IKKα/β调控高糖诱导血管内皮细胞胰岛素抵抗及功能失常的NF-κB非依赖途径

论文摘要

目的：观察高糖诱导血管内皮细胞胰岛素抵抗（IR）及功能失常时IKKa/p表达或活性变化,并探讨IKKα/β调控高糖诱导血管内皮胰岛素抵抗及功能失常的NF-κB非依赖机制。方法：将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,均匀接种在六孔培养板上,随机分为3个组：（1）正常组（Control）:DMEM（含Glu 5.5 mmol/L）完全培养液,（2）高糖组（HG）:DMEM（含Glu 33 mmol/L）完全培养液,（3）甘露醇组（MNT）：DMEM（含Glu 5.5mmol/L+MNT27.5 mmol/L）。HUVECs在上述不同的培养液中于37℃、5%C02培养48 h,然后用胰岛素（100nmol/L）处理细胞30 min,收集细胞,然后检测以下指标：①细胞上清液中NO和ET水平；②HUVECs中IKKα/βmRNA的表达水平；③HUVECs中IKKa/(3蛋白的表达水平；④HUVECs中p-IKKa/p （Ser176/181）、p-IRS-1 （Ser312）和p-Raf-1 （Ser338）表达水平；⑤IKKa/p和IRS-1以及IKKa/p和Raf-1相互作用。结果：①细胞上清液中NO和ET-1水平：HG显著诱导HUVECs胰岛素抵抗及功能失常,表现为NO水平降低和ET-1水平升高,与Control组相比具有显著性差异（P<0.01）,而与葡萄糖等渗透压的MNT对细胞无明显影响（P>0.05）。②HUVECs中IKKα/βmRNA的表达水平：HUVECs用HG培养48h后,IKKα/βmRNA表达明显上调,而与葡萄糖等渗透压的MNT对IKKα/βmRNA表达无明显影响。③HUVECs中IKKα/β蛋白的表达水平：结果与IKKα/βmRNA的表达水平相似。④HUVECs中p-IKKα/β（Ser176/181）、p-IRS-1（Ser312）和p-Raf-1（Ser338）表达水平：HG可明显上调p-IKKα/β（Serl76/181）、p-IRS-1（Ser312）和p-Raf-1（Ser338）表达水平,与葡萄糖等渗透压的MNT对p-IKKα/β（Ser176/181）、p-IRS-1（Ser312）和p-Raf-1（Ser338）表达水平无明显影响。⑤IKKα/β和IRS-1以及IKKα/β和Raf-1相互作用：免疫共沉淀研究发现,HUVECs无论是否经过HG处理,IKKα/β均可与IRS-1或Raf-1发生相互作用。结论：①HG可上调HUVECs中1KKa/β的表达并可激活IKKα/β活性；②IKKα/β可通过与IRS-1和Raf-1相互作用并磷酸化IRS-1和Raf-1调控高糖诱导血管内皮胰岛素抵抗及功能失常。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写及全文和中文对照表
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 主要材料及试剂
• 2.2 实验主要仪器和设备
• 2.3 实验步骤
• 2.3.1 试剂的配制
• 2.3.2 实验分组及处理方法
• 2.3.3 HUVECs NO水平的检测
• 2.3.4 HUVECs ET-1水平的检测
• 2.3.5 HUVECs IKKα/β mRNA表达检测
• 2.3.6 Western blotting法检测HUVECs IKKα/β等蛋白的表达
• 2.3.7 免疫共沉淀法检测IKKα/β与IRS-1或Raf-1相互作用
• 2.4 数据处理
• 第3章 结果
• 3.1 HG对HUVECs中NO和ET-1水平的影响
• 3.2 高糖对HUVECs IKKα/β mRNA表达水平的影响
• 3.3 高糖对HUVECs IKKα/β蛋白表达水平的影响
• 3.4 高糖对HUVECs IKKα/β活性的影响影响
• 3.5 高糖对HUVECs IRS-1（ser312）和Raf-1（ser338）磷酸化影响
• 3.6 IKKα/β与IRS-1或Raf-1相互作用
• 第4章 讨论
• 4.1 高糖与IKKα/β的表达和活化
• 4.2 IRS-1与胰岛素抵抗
• 4.3 Raf-1与胰岛素抵抗
• 4.4 研究的不足之处
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 参考文献