簇毛麦cDNA文库构建及小麦抗病相关基因克隆与功能分析

论文题目: 簇毛麦cDNA文库构建及小麦抗病相关基因克隆与功能分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物遗传育种

作者: 陈雅平

导师: 陈佩度

关键词: 小麦簇毛麦,易位系,簇毛麦文库,抑制性扣除杂交,白粉病抗性相关基因,基因表达,共显性分子标记

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 小麦白粉病是由白粉病菌(Erysiphe graminis Dc.f.sp tritic Marchal)引起的世界性真菌病害，培育抗性品种是控制白粉病的有效途径。上世纪八、九十年代我国原有的抗白粉病小麦品种大部分都含有Pm8抗源，但是随着白粉菌生理小种的不断变化，Pm8已经逐渐失去了抗性，寻找和利用新的白粉病抗性基因对于我国小麦生产有重要意义。南京农业大学细胞遗传所培育的6VS／6AL易位系带有的抗白粉病基因Pm21抗性强、抗谱广，因此对Pm21基因及白粉病抗性相关基因进行克隆具有重要的意义。构建cDNA文库是基因克隆的基础，但是由于小麦基因组庞大，所需文库含克隆数太多，后续筛选工作较为复杂，所以本研究以Pm21基因供体物种簇毛麦(2n=14，VV)为材料构建了白粉菌诱导的簇毛麦叶片cDNA文库。此文库包含30万个重组克隆，平均插入片段为1.6kb，用本研究克隆到的谷胱甘肽还原酶(Ta-GR)基因，蓝铜结合蛋白基因(BCB)和谷胱甘肽硫转移酶基因(GST)等作探针进行杂交筛库，杂交信号明显，重复性好。根据抗病基因保守结构域设计简并引物以及以数据库中已经定位的小麦ESTs序列为基础设计特异引物，以经白粉菌诱导后的抗病易位系和感病扬麦5号cDNA为模板进行RT-PCR筛选。共获得4个与小麦白粉病抗性相关的侯选基因。其中，利用特异引物，从易位系中分离获得了两个cDNA片段(Ta-RPM,Ta-M1a)，它们的核苷酸序列分别与大麦NBS-LRR类抗病蛋白(AAB96982.1)及大麦CC-NBS-LRR抗病蛋白MLA13基因(AF523682.1)序列同源性为64％和87％。利用简并引物从易位系cDNA中扩增获得两个cDNA序列(Th8，Th12)，推测TH8为小麦蛋白激酶基因片段，TH12为小麦单脱氢抗坏血酸还原酶基因片段，利用中国春缺体四体将TH8和TH12分别定位于小麦5D和3D染色体上。并对上述分离的基因进行了序列比较研究和蛋白一级、二级结构比较分析。应用抑制性消减杂交(SSH)技术，以Pm21受体亲本扬麦5号及与其回交7代的小麦／簇毛麦6VS／6AL易位系为材料，建立白粉菌诱导的叶片SSH文库，获得500个阳性克隆，对其中部分克隆测序，并与GenBank中的序列进行BLAST分析，获得12个与抗病相关的EST序列。本研究详细地分析了其中三个EST(Ta-APX,Ta-LRR2，HvGR)。通过电子克隆方法首次克隆到了全长小麦抗坏血酸过氧化物酶基因(Ta-APX)，并根据全长序列设计特异引物，利用中国春缺体四体基因组DNA为模板进行PCR扩增，将Ta-APX定位于小麦第七部分同源群7A和7D染色体上。构建表达载体pET32(a)

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一部分文献综述

第一章 cDNA文库的发展和应用

一、RNA制备

二、cDNA第一链的合成及改进

1、反转录酶的种类与选择优化

2、反转录引物的选择

三、cDNA第二链的合成

1、cDNA第二链的合成方法

2、提高双链DNA的合成效率

四、cDNA的分子克隆及发展

五、克隆载体的改造

1、质粒载体的改造

2、入噬菌体载体的改造

六、cDNA文库的应用

1、获得目的基因全长cDNA

2、获得RFLP和SSR分子标记

3、基因结构分析

七、cDNA文库的发展

第二章植物与病原物互作的相关基因

一、病原物无毒基因及其产物

1、细菌的无毒基因

2、病毒的无毒基因

3、真菌的无毒基因

二、植物R基因及其产物

1、R基因结构

2、植物抗病基因在染色体上的组织分布与分子进化

3、植物抗病基因功能分析

3.1 R基因的专化性识别

3.2 植物细胞中R蛋白的定位

3.3 NBS-LRR的功能

4、R基因的信号传导

三、病原物hrp基因及其产物

1、hrp基因簇

2、harpin蛋白

3、harpin蛋白的受体HrBP1

第三章植物抗病基因克隆策略

一、转座子标签技术

二、图位克隆技术

三、异源基因克隆法

四、基因差异表达克隆法

第四章克隆基因的表达系统

一、原核表达体系

1、原核表达载体

2、原核表达产物检测

3、原核表达存在的缺陷

二、真核表达体系

1、酿酒酵母表达体系

1.1 酿酒酵母表达系统的组成

1.2 酿酒酵母表达系统的应用及前景

1.3 酿酒酵母基因表达系统研究现状及其优缺点

2、转基因动物和植物

三、优化基因表达的关键因素

1、密码子最佳化(codon optimization)

2、翻译终止效率

3、真核细胞中的异源蛋白表达

4、融合蛋白表达系统的重大突破

5、裂解融合蛋白以除去fusion tag

6、表达蛋白的可溶性

7、表达蛋白的稳定性

第二部分研究报告

第一章簇毛麦叶片cDNA文库构建

一、材料与方法

1、植物材料

2、方法

2.1 总RNA提取

2.2 mRNA分离

2.3 cDNA文库构建

二、结果

1、白粉菌诱导的簇毛麦叶片cDNA文库构建

2、文库筛选试验

三、讨论

第二章小麦抗病相关基因的克隆与功能分析

一、材料与方法

1、材料

1.1 植物材料

1.2 载体和菌株

2、方法

2.1 总RNA提取

2.2 mRNA的分离

2.3 SSH

2.4 cDNA第一链合成

2.5 第一链cDNA浓度定量

2.6 PCR反应

2.7 RACE(Rapid amplification of cDNA ends)

2.8 扩增产物的电泳分离、回收、克隆

2.9 阳性克隆的测序

2.10 核苷酸序列及蛋白一级、二级结构比较分析

2.11 Southern杂交

2.12 Northern杂交

2.13 PAGE电泳和染色

2.14 大肠杆菌表达载体构建

2.15 表达载体转化入溶源性大肠杆菌BL21(DE3)及鉴定

2.16 溶源菌BL21(DE3)中检测表达产物

2.17 体外检测抗坏血酸过氧化物酶(TaAPX)基因活性

2.18 APX活力测定

2.19 酿酒酵母感受态细胞的制备和低温保存

2.20 酿酒酵母感受态细胞的转化(醋酸锂法)

2.21 酿酒酵母转化子PCR法快速鉴定

2.22 功能互补试验

2.23 酵母RNA提取

二、结果与分析

1、利用RT-PCR克隆抗病相关序列

1.1 利用兼并引物克隆抗病相关基因及其特征分析

1.2 利用特异引物分离抗病相关基因及其特征分析

2、小麦-簇毛麦6VS／6AL易位系与扬麦5号叶片SSH文库构建

2.1、6VS／6AL易位系与扬麦5号叶片SSH文库的建立

2.2、SSH文库的差式筛选

3、小麦抗坏血酸过氧化物酶基因(Ta-APX)的克隆与表达分析

3.1、TaAPX基因的cDNA克隆与序列分析

3.2 pET-32(a)-TaAPX表达载体的构建及在BL21中的表达产物分析

3.3 体外检测抗坏血酸过氧化物酶(Ta-APX)活性

3.4 白粉病诱导后APX活力变化及TaAPX基因的表达分析

4、谷胱甘肽还原酶基因的克隆和表达分析

4.1 易位系中谷胱甘肽还原酶(GR)基因全长克隆

4.2 Hv-GR全长基因克隆及结构分析

4.3 Hv-GR基因的表达分析

4.4 酿酒酵母载体的构建及在酵母中表达

4.5 酵母表达

4.6 Hv-GR在突变体酿酒酵母中的功能互补试验

4.7 融合载体的构建及瞬间表达

5、小麦LRR基因的克隆、表达以及应用

5.1 cDNA克隆和测序

5.2 Ta-LRR2表达分析

5.3 Ta-LRR2的染色体定位

5.4 作为分子标记检测Pm21基因

三、讨论

1、利用RT-PCR克隆抗病相关基因

1.1 由兼并引物扩增得到的小麦基因

1.2 根据EST设计特异引物得到的NBS-LRR基因片段

2、扬麦5号与6VS／6AL易位系叶片SSH文库构建及筛选

3、小麦抗坏血酸过氧化物酶基因(Ta-APX)

4、簇毛麦谷胱甘肽还原酶基因(Hv-GR)

5、基于Ta-LRR2序列的与Pm21基因紧密连锁的RGAP标记的开发

全文结论

参考文献

附录

致谢

发布时间: 2006-10-20

簇毛麦cDNA文库构建及小麦抗病相关基因克隆与功能分析

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