结核病复发及结核分枝杆菌耐药机制的研究

论文摘要

结核病是一种古老的传染性疾病，在历史上曾经夺取数以万计的生命。近年来由于全球人口流动的加速，人类免疫缺陷病毒感染的流行，耐药菌株的出现和传播，以及其它一些经济和政策等方面的原因，使得结核病卷土重来，再次构成对人类健康的重大危害。我国的结核病控制工作尽管已经取得了很大的进步，但是形势依然很严峻。结核病的复发已成为我国结核病实际防治工作中面临的难题。本研究根据我国较高的结核病复发率，选择上海地区的复发病人作为研究对象，利用基因型分型技术，对复发的病因学进行了研究。同时，针对复发患者中较高的耐药率，在文献综述的基础上，对一线抗结核药物乙胺丁醇(ethambutol，EMB)特殊的耐药现象及其耐药分子机制进行了探索性研究。全文分二个部分：第一部分结核病复发的病因学研究为研究结核病复发的病因学，首先评估了一种新的结核分枝杆菌基因型分型法—分枝杆菌散在分布重复单位基因型分析法(MIRU)。随机抽取上海地区2000年至2002年分离保存的91株菌株，对其进行MIRU分型。发现91株菌株用该分型法可得到46种基因型。12个MIRU位点的多态性分析表明各位点之间有较大的区别，其中位点26显示了较高的多态性，位点16、31、40显示了中等程度的多态性。与另一种以PCR为基础的基因型分析技术Spoligotyping相比，MIRU显示了较好的分辨率。进一步以上海地区1999年至2004年复发肺结核患者为对象，通过比较复发患者前后两次发病时结核分枝杆菌MIRU基因型的差异，来判断结核病复发的真正原因。在52例结核病复发患者中，32例患者两次发病时结核分枝杆菌的MIRU基因型发生了变化，提示62％的结核病患者的复发是由于外源性再感染而引起的。随着年龄的增加，由外源性再感染所致复发的可能性逐步降低，≤30岁、31～60岁、≥60岁复发患者中外源性再感染的比例分别为100％(4／4)、67％(12／18)、53％(16／30)。随着复发间隔时间的延长，结核病复发患者中由外源性再感染所致的可能性逐步增加，6个月内复发的患者中47％(7／15)是由外源性再感染引起的，而1年以后这个比例达到74％(17／23)。复发患者中较高的外源性再感染比例提示结核病近期传播现象较严重，结核病防治工作中应当加强传染源的早期发现，切断传播途径。外源性再感染在结核病患者中常见，也说明人体免疫系统缺乏有效的保护机制，不能保护机体免受结核分枝杆菌再次感染，这对结核病预防性疫苗的研究和开发提出了新的挑战。第二部分结核分枝杆菌EMB耐药的分子机制研究EMB是一种目前普遍采用的一线抗结核药物。先前的研究发现乙胺丁醇耐药常常与其它耐药联系在一起，为了观察这种现象是否与不同地区的菌株流行相关，本研究对上海市10年来保存的菌株的药敏结果进行了分析。结果表明，单耐EMB的菌株数显著少于单耐其它常用抗结核药物(异烟肼、利福平和链霉素)的菌株数。在耐两种以上药物的菌株中，耐EMB的菌株数量与菌株耐药种类的数目成正相关，提示菌株耐EMB与耐其它抗结核药物存在相关性。为研究embB306位点突变与菌株耐药的关系，本研究分析了116株耐药菌株和54株全敏感菌株embB306位点的突变情况。结果发现，在所有耐EMB的27株菌株中，共检测到embB306位点突变17株，在不耐EMB但耐其它药物的89株菌株中也检测到突变17株，在全敏感菌株中没有检测到embB306位点的突变。经统计学检验，embB306突变不仅与EMB耐药之间存在相关性，也与耐其它常用抗结核药物存在相关性。同时也发现embB306突变所占的比例随着耐药种类的增加而增加。由于临床上EMB单独耐药菌株数目较少，因而检测embB306位点的突变对检测菌株EMB单独耐药的实际意义不大。但embB306位点突变与菌株耐多药之间存在一定的相关性，因而检测该位点的突变可以作为快速筛查临床耐多药菌株的候选分子标记。结核分枝杆菌产生耐药的机制与其它细菌略有不同，质粒、转座子以及整合子等以基因水平传播方式介导的耐药机制较少见，染色体上的缺失和突变被认为是其产生耐药的主要方式。为进一步深入理解分枝杆菌EMB耐药产生的分子机制，以耻垢分枝杆菌作为研究模型，采用转座子突变技术研究与EMB耐药相关的新基因。使用基于Himar1转座子的MycoMarT7转座子系统，构建了耻垢分枝杆菌转座子突变文库。Southern blot实验证实Himar1转座子以随机单拷贝插入的方式分布在染色体上。进一步对该文库进行EMB耐药筛选，分离获得了4个耐药突变株分别命名为ER2A、ER4A、ER5A和ER7A，经MIC测定其耐药能力比野生型提高了20倍以上。使用接头PCR和标记挽救方法鉴定了各突变株中转座子在基因组中的插入位点。生物信息学分析表明，ER2A突变菌株中转座子插入部位基因编码单加氧酶，该酶可能参与分枝杆菌中间产物的代谢；ER4A突变株插入部位的基因为lprE，编码一种细胞内的脂蛋白；ER5A突变株插入部位的基因为编码转运蛋白的arsA；ER7A突变株中插入部位编码的基因功能未知。这些新分离到基因耐乙胺丁醇的机制有待进一步深入研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 结核病复发的病因学研究
• 第一章 结核病分子流行病学概述（文献综述）
• 1、结核病分子流行病学常用的基因型分型方法
• 2、分子流行病学对结核病传播规律的新发现
• 3、分子流行病学方法研究结核病临床相关的疑难问题
• 4、进一步研究方向
• 5、研究目的
• 第二章 结核分枝杆菌基因型分型方法MIRU的建立
• 1、引言
• 2、材料与方法
• 3、结果
• 4、讨论
• 第三章 利用基因型分型技术研究结核病复发的原因
• 1、引言
• 2、材料与方法
• 3、结果
• 4、讨论
• 第二部分 结核分枝杆菌耐乙胺丁醇的分子机制研究
• 第一章 结核分枝杆菌耐药的分子机制（文献综述）
• 1、结核杆菌耐链霉素的分子机制
• 2、结核杆菌耐异烟肼的分子机制
• 3、结核杆菌耐利福平的分子机制
• 4、结核杆菌耐吡嗪酰胺的分子机制
• 5、结核杆菌耐乙胺丁醇的分子机制
• 6、研究目的
• 第二章 结核分枝杆菌embB基因306位点突变与耐药的相关性研究
• 1、引言
• 2、材料和方法
• 3、结果
• 4、讨论
• 第三章 利用转座子突变技术分离分枝杆菌耐乙胺丁醇相关新基因
• 1、引言
• 2、材料与方法
• 3、结果
• 4、讨论
• 参考文献
• 论文总结及创新点
• 全文总结
• 主要创新点
• 附录
• 致谢