论文摘要
研究目的与意义:流感病毒感染可引起人呼吸系统疾病,同时亦可感染中枢神经系统（CNS）,导致部分感染人群产生CNS病变。在流感相关性脑病与脑炎综合征病人的脑脊液中促炎症细胞因子浓度出现异常升高。神经胶质细胞,尤其是小胶质细胞和星形胶质细胞是CNS细胞因子产生的主要来源,但其在流感病毒感染CNS时的功能仍不清楚。因此,探索小胶质细胞和星形胶质细胞在流感病毒感染后所发生的病理变化及免疫反应,为明确胶质细胞在感染中的作用、理解CNS感染流感病毒后的发病机制提供必要的实验依据。此外,根据人流感病毒基因组核酸的类型、进化趋势及预实验的线索,推测流感病毒与APOBEC家族蛋白存在可能的潜在相关性。探寻APOBEC与流感病毒复制及突变的关系,为寻找对流感病毒具有潜在抑制作用的因子、理解病毒进化因素提供新的思路。实验方法:1.明确病毒遗传背景、建立反向遗传平台:选取人A/Shantou/169/2006（H1N1）和禽A/Chicken/Guangdong/1/05（H5N1）流感病毒,对病毒全基因组进行克隆测序,构建反向遗传通用载体及含上述两种病毒全基因组片段的质粒;2.探讨胶质细胞感染流感病毒后的病理变化和免疫反应:分离培养小鼠神经胶质细胞,检测流感病毒受体;使用遗传背景明确的H1N1和H5N1感染小胶质细胞及星形胶质细胞,检测病毒复制、病毒生长曲线、细胞病变、细胞因子基因转录水平及蛋白分泌变化;使用人胶质细胞,检测流感病毒感染后APOBEC家族基因转录水平变化;3.探讨APOBEC家族蛋白与流感病毒复制及突变频率的关系:克隆APOBEC家族成员并构建MDCK表达细胞系,检测流感病毒在APOBEC表达细胞上的复制效率与突变频率。实验结果:1.完成了人H1N1和禽H5N1流感病毒的纯化培养及基因组的克隆与测序;2.成功构建了CMV及Pol I双向启动子的反向遗传载体,及两株流感病毒全基因组反向遗传质粒;3.亲和荧光实验表明小鼠胶质细胞存在禽及人流感病毒受体SA-α2,3-Gal和SA-α2,6-Gal;4.小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞均可被流感病毒感染并产生子代病毒。小胶质细胞对流感病毒的敏感性和复制效率高于星形胶质细胞,H1N1复制效率高于H5N1;5.流感病毒感染胶质细胞可产生细胞病变效应（CPE）并诱导细胞凋亡,小胶质细胞的CPE和凋亡率高于星形胶质细胞:6.流感病毒感染可诱导小胶质细胞和星形胶质细胞的促炎症细胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-6及TNF-α）及趋化因子（CCL-2、-3、-5及CXCL-2、-9、-10）的mRNA水平上调;H5N1的感染能诱导更强烈的上调反应;7. ELISA结果表明,小胶质细胞和星形胶质细胞在流感病毒感染后,促炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量上调;H5N1的感染能诱导更强烈的上调反应;8.小鼠胶质细胞表达APOBEC3,人胶质细胞表达APOBEC-3B、-3C、-3F和-3G,在流感病毒感染后,其转录水平发生上调;9.克隆并表达了人APOBEC-1、-2、-3A、-3B、-3C、-3F、-3G、-3H、-4和AID,小鼠APOBEC-3和大鼠APOBEC-1,其中hA3F和hA3G构建了稳定转染的细胞系; 10.在证实hA3F和hA3G的表达不受流感病毒封闭,且具有抑制HBV复制活性的情况下,表明hA3F和hA3G对流感病毒的复制效率及基因突变频率无明显作用;其它APOBEC家族成员尚未发现具有明显抑制流感病毒复制的潜力。结论:1.成功构建了反向遗传通用载体及两株流感病毒的全基因组反向遗传质粒;2.小鼠胶质细胞表面存在人流感病毒受体SA-α2,6-Gal及禽流感病毒受体SA-α2,3-Gal,人及禽流感病毒均可感染小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞,并进行有效复制产生具有感染性的子代病毒;3.流感病毒的感染可对小鼠胶质细胞产生以CPE和凋亡为特征的直接损伤作用,其中小胶质细胞对流感病毒更为敏感;4.流感病毒感染可诱导小鼠胶质细胞产生促炎症细胞因子反应为特征的炎症反应;其中H5N1可诱导更为强烈的促炎症因子反应;5.流感病毒可诱导胶质细胞APOBEC蛋白家族成员表达上调,但人APOBEC-3F和-3G对流感病毒的复制效率和基因突变频率无明显作用,其它APOBEC家族成员亦无明显抑制流感病毒复制的能力。
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中文摘要Abstract英文缩略词表第一章 绪论1.1 流感病毒及其反向遗传系统1.2 流感病毒与中枢神经系统感染1.3 抗病毒细胞因子与APOBEC 家族1.4 论文的研究目的、意义及内容1.5 参考文献第二章 流感病毒H1N1 和H5N1 全基因组克隆及反向遗传载体的构建2.1 材料与方法2.1.1 病毒及生物安全操作2.1.2 分子生物学、免疫学、细胞培养及病毒学的常规操作2.1.3 流感病毒毒株及细胞2.1.4 病毒的空斑纯化2.1.5 反向遗传双向转录/表达通用载体的构建2.1.6 病毒基因组RNA 的提取2.1.7 病毒基因组RNA 的反转录2.1.8 病毒基因组片段的PCR2.1.9 流感病毒8 质粒反向遗传质粒的构建2.1.10 流感病毒H1N1 和H5N1 基因组测序及分析2.2 结果2.2.1 两株流感病毒在MDCK 细胞上的增殖特性2.2.2 人流感病毒A/Shantou/169/06（H1N1）全基因组8 片段RT-PCR2.2.3 禽流感病毒A2.2.4 反向遗传通用载体的构建与鉴定2.2.5 禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/1/2005 基因组序列2.2.6 人流感病毒A/Shantou/169/2006 基因组序列2.2.7 含有H1N1 及H5N1 病毒全基因组片段的反向遗传质粒的构建2.3 讨论2.4 小结2.5 参考文献第三章 流感病毒诱导胶质细胞凋亡及炎症因子释放3.1 材料与方法3.1.1 实验动物3.1.2 病毒及生物安全操作3.1.3 流感病毒毒株3.1.4 流感病毒的纯化3.1.5 新生小鼠大脑皮层神经胶质细胞的培养3.1.6 小鼠大脑皮层小胶质细胞与星形胶质细胞的分离3.1.7 免疫荧光及流式细胞术检测小胶质细胞与星形胶质细胞的纯度3.1.8 流感病毒受体的检测3.1.9 流感病毒感染神经胶质细胞3.1.10 流感病毒空斑检测3.1.11 流感病毒在胶质细胞中的生长曲线3.1.12 Annexin V/ PI 双染法检测细胞凋亡3.1.13 流感病毒核蛋白的免疫荧光检测3.1.14 胶质细胞RNA 的提取及反转录3.1.15 小鼠胶质细胞感染流感病毒后炎症相关因子的半定量PCR 检测3.1.16 酶联免疫吸附实验（ELISA）3.1.17 小鼠胶质细胞感染流感病毒后抗病毒因子的表达变化检测3.1.18 人胶质细胞的分离与培养3.1.19 人胶质细胞感染流感病毒后APOBEC 家族基因表达变化检测3.2 结果3.2.1 小鼠胶质细胞的分离与培养3.2.2 小胶质细胞与星形胶质细胞的纯度鉴定3.2.3 胶质细胞表面的流感病毒受体分布3.2.4 流感病毒感染小胶质细胞和星形胶质细胞3.2.5 流感病毒在小胶质细胞和星形胶质细胞中的复制动力学3.2.6 流感病毒感染诱导的神经胶质细胞凋亡3.2.7 流感病毒感染神经胶质细胞后炎症相关细胞因子基因表达变化3.2.8 流感病毒感染后胶质细胞IL-1β分泌上调3.2.9 流感病毒感染后胶质细胞IL-6 分泌上调3.2.10 流感病毒感染后胶质细胞TNF-α分泌上调3.2.11 流感病毒感染后胶质细胞抗病毒因子表达变化3.2.12 人原代神经胶质细胞的分离与培养3.2.13 人胶质细胞感染流感病毒后APOBEC 家族基因表达变化3.3 讨论3.4 小结3.5 参考文献第四章 APOBEC 家族基因的克隆表达及其对流感病毒复制的影响4.1 材料与方法4.1.1 质粒4.1.2 细胞及培养基4.1.3 引物4.1.4 APOBEC 家族基因的克隆4.1.5 稳定表达hA3F 和hA3G 的MDCK 细胞系的构建4.1.6 hA3F 和hA3G 蛋白的细胞定位检测4.1.7 MDCK 及A549 细胞的转染4.1.8 半数组织培养感染剂量（TCID50）检测4.1.9 流感病毒在稳定表达hA3F 和hA3G 的MDCK 细胞中复制效率检测4.1.10 其它APOBEC 家族蛋白对流感病毒复制效率的影响4.1.11 hA3F 和hA3G 在HepG2.2.15 细胞模型上抑制HBV 复制效率的检测4.1.12 流感病毒基因组突变率的检测4.2 结果4.2.1 APOBEC 家族基因的克隆及表达载体的构建4.2.2 hA3F 和hA3G 表达细胞系的Western blotting 检测4.2.3 hA3F 和hA3G 表达细胞系中阳性表达细胞的比例4.2.4 hA3F 和hA3G 重组蛋白在细胞内的定位4.2.5 流感病毒在hA3F 和hA3G 表达细胞中的TCID50 滴度4.2.6 流感病毒在稳定表达hA3F 和hA3G 的MDCK 细胞中的空斑滴度4.2.7 不同感染剂量流感病毒在MDCK 细胞中各时相的复制效率4.2.8 流感病毒感染后细胞hA3F 和hA3G 表达水平4.2.9 hA3F 和hA3G 表达载体在HepG2.2.15 细胞中抑制HBV 复制4.2.10 其它APOBEC 家族蛋白对流感病毒复制的影响4.2.11 hA3F 和hA3G 对流感病毒基因组无显著的超突变作用4.3 讨论4.4 小结4.5 参考文献附录1 流感病毒A/Shantou/169/2006（H1N1）氨基酸序列附录2 APOBEC 家族成员DNA 序列结论论文的创新点博士期间发表及待发表的论文研究生简历致谢
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