农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的稻瘟病菌转化及致病相关基因研究

论文摘要

DNA插入突变是标记、分离植物病原真菌功能基因的有效途径之一。本实验通过电转化法将双元载体pATMT1导入农杆菌AGL-1中,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）转化,转化效率达每106个分生孢子＞250个转化子,并得到了1500多个转化子。对部分转化子的继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。用大麦叶片离体接种的方法快速测定稻瘟病菌转化子的致病性,发现2个致病缺陷突变体:A1-192和A1-139,5个转化子的生长速度明显减慢,8个转化子的产孢量明显减少。A1-192菌株不能侵入感病大麦和水稻品种的叶片。A1-139突变体则不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,初步说明A1-139突变体的穿透和扩展进程同时被阻断。进一步的表型分析,发现A1-139突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的0.7%,在疏水表面不能形成附着胞。Southern杂交显示A1-192基因组中的T-DNA为单拷贝插入,而A1-139基因组中T-DNA插入是双拷贝的。上述结果表明,A1-192突变体表型的改变可能是由于T-DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。A1-139表型改变可能与两个T-DNA插入位点或其中之一的位点有关。分别用嵌套式反向PCR和HiTAIL-PCR扩增得到A1-192和A1-139突变体的插入T-DNA侧翼基因组序列。通过克隆、测序和BLAST分析,A1-192菌株的T-DNA插入点位于编码一个MAPK基因-MPS1（MGG 04943.5）启动起始位点ATG上游456bp处。而A1-139突变体T-DNA双拷贝分别插在MGG 01057.5和MGG 10568.5基因的CDS中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 稻瘟病与稻瘟病菌
• 1.1.1 稻瘟病菌的生活史
• 1.1.2 稻瘟病菌的侵染循环
• 1.1.3 稻瘟病菌是丝状病原真菌研究的模式生物
• 1.2 根癌农杆菌介导的转化
• 1.2.1 丝状真菌遗传转化的研究进展
• 1.2.2 ATMT在丝状真菌上的应用现状
• 1.2.3 根癌农杆菌（T-DNA）介导真菌遗传转化的机理
• 1.2.4 根癌农杆菌介导的丝状真菌转化的特点
• 1.2.5 根癌农杆菌介导丝状真菌转化的常规方法
• 1.3 侧翼序列克隆技术研究
• 1.3.1 反向PCR技术
• 1.3.2 TAIL-PCR热不对称交错PCR
• 1.3.3 外源接头PCR
• 1.3.4 本实验室常用的侧翼序列克隆改进方法
• 1.4 本研究的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验菌株、质粒与培养条件
• 2.2 培养基及抗生素
• 2.3 常规分子生物学实验技术
• 2.3.1 PCR反应
• 2.3.2 酶切反应
• 2.3.3 DNA的琼脂糖电泳
• 2.3.4 DNA片段的凝胶回收
• 2.3.5 连接反应
• 2.3.6 大肠杆菌感受态细胞制备
• 2.3.7 大肠杆菌转化
• 2.3.8 CTAB法提取质粒DNA
• 2.4 农杆菌的冻融法转化
• 2.4.1 农杆菌AGL-1电感受态制备
• 2.4.2 pATMT1质粒的电转化
• 2.4.3 质粒PCR验证
• 2.5 稻瘟病菌的T-DNA转化
• 2.6 转化子DNA提取与分析
• 2.6.1 CTAB法提取基因组DNA
• 2.6.2 T-DNA插入的分子检测
• 2.6.3 Southern杂交分析
• 2.7 T-DNA插入侧翼序列的测序与插入位点的分析和验证
• 2.8 突变子的表型分析
• 2.8.1 生长速度与产孢量
• 2.8.2 孢子萌发与附着胞形成观察
• 2.8.3 致病性测定
• 2.8.4 稻瘟病菌的有性生殖交配试验
• 3 结果与分析
• 3.1 双元载体pATMT1导入农杆菌
• 3.2 稻瘟病菌的T-DNA转化
• 3.2.1 方法优化
• 3.2.2 诱导培养
• 3.2.3 选择培养基中抗生素的选择
• 3.2.4 转化效率
• 3.3 突变体的检测
• 3.3.1 突变体插入稳定性检测
• 3.3.2 转化子潮霉素PCR检测
• 3.3.3 突变体致病性测定结果
• 3.4 T-DNA插入侧翼序列的扩增
• 3.4.1 嵌套式反向PCR扩增Al-192左臂侧翼序列
• 3.4.2 HiTAIL-PCR扩增Al-139侧翼序列
• 3.5 致病缺陷突变体Al-192和Al-139分析
• 3.5.1 致病性测定
• 3.5.2 Al-192、Al-139突变体的表型分析
• 3.5.3 Al-192、Al-139突变体的T-DNA插入拷贝数
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢