O-GlcNAc修饰在乳腺癌转移过程中的作用及其机制研究

论文摘要

O-GlcNAc是一种广泛存在于蛋白质丝/苏氨酸残基上的一种动态、可逆的蛋白翻译后修饰;与经典的糖基化修饰不同,它主要分布在细胞浆和细胞核中。O-GlcNAc修饰基团的添加和移除分别是由糖基转移酶（O-GlcNAc transferase,OGT）和糖苷酶（O-GlcNAcase,OGA）完成的。O-GlcNAc不仅参与了生物体绝大多数正常生理功能的调控,还可能在多种疾病的发病过程中发挥重要的作用,近年来的一些研究已经证明O-GlcNAc的异常与神经退行性疾病、糖尿病和心血管疾病等相关。然而,在O-GlcNAc与肿瘤的研究方面,虽然目前已发现多种与肿瘤相关的蛋白可以被O-GlcNAc修饰（例如p53、c-Myc等）,但是O-GlcNAc与肿瘤的确切关系或者说O-GlcNAc是否参与了肿瘤发生和发展过程还未见报道。因此,本论文对O-GlcNAc与乳腺癌的发生和发展进行了系统的研究,并探讨了O-GlcNAc调节小鼠乳腺癌肺转移的分子机制。首先,利用慢病毒shRNA表达载体构建了小鼠OGT基因沉默载体,并对小鼠乳腺癌细胞4T1中的OGT表达进行稳定、高效的沉默,从而建立了O-GlcNAc修饰抑制的乳腺癌细胞模型;其次,利用糖苷酶OGN的特异性抑制剂O-（2-acetamido-2-deoxy-d-glucopyranosylidene）amino-N-phenylcarbamate（PUGNAc）处理4T1细胞,从而使细胞中总体O-GlcNAc修饰水平升高。MTT法和细胞计数实验表明,O-GlcNAc不能影响4T1细胞的体外增殖能力;软琼脂克隆形成实验表明,O-GlcNAc对4T1细胞的锚定非依赖性生长能力也没有显著影响;Transwell小室法检测O-GlcNAc对4T1细胞迁移能力的影响,结果表明,OGT的沉默能显著抑制细胞的迁移能力而PUGNAc处理能显著促进细胞的迁移能力。在体外实验的基础上,利用小鼠乳腺癌模型检测了OGT沉默对4T1细胞肿瘤形成能力和转移能力的影响,结果表明,OGT沉默不能影响肿瘤的形成但能显著抑制乳腺癌细胞的肺转移能力。上述实验结果表明,O-GlcNAc在乳腺癌肺转移过程中发挥重要作用,因此,我们对其作用机制进行了进一步的研究。WB和激光共聚焦实验表明,OGT沉默可以促进E-cadherin的表达和膜分布而PUGNAc处理能抑制E-cadherin的表达和膜分布。免疫沉淀和激光共聚焦实验表明,O-GlcNAc可以抑制E-cadherin和β-catenin、p120的相互作用,这可能是O-GlcNAc抑制E-cadherin的表达和膜分布的分子机制。由于E-cadherin在许多肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用,所以我们推测O-GlcNAc很可能通过调节E-cadherin的表达和膜分布影响乳腺癌细胞的迁移和转移。利用RNAi技术构建了E-cadherin基因沉默细胞模型和OGT/E-cadherin双基因沉默细胞模型。细胞迁移实验表明,E-cadherin的表达水平与乳腺癌细胞的迁移能力负相关,PUGNAc处理能显著促进对照细胞的迁移而对E-cadherin基因沉默细胞的迁移没有显著影响;E-cadherin的沉默可以回复OGT基因沉默对4T1细胞的迁移抑制作用。这些结果表明,O-GlcNAc可以通过E-cadherin调节乳腺癌细胞的迁移。ERK1/2信号在许多肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用,实验中我们发现O-GlcNAc可以促进乳腺癌细胞的ERK1/2活性。进一步的实验显示,MAPK通路抑制剂PD98059可以抑制ERK1/2活性和乳腺癌细胞的迁移,这表明O-GlcNAc可能会通过调节ERK1/2活性影响乳腺癌细胞的迁移。综上所述,本文利用分子生物学和细胞生物学的方法,首次证明了O-GlcNAc在小鼠乳腺癌肺转移过程中的作用,并阐明了促进乳腺癌细胞迁移的分子生物学机制。本文的研究不仅对于阐明乳腺癌转移及其分子机制具有重要的理论意义,而且为乳腺癌的诊断及治疗提供了新的靶点和研究思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 O-GlcNAc的生物合成
• 1.1 O-GlcNAc糖基转移酶（OGT）
• 1.2 O-GlcNAc糖苷酶（OGA）
• 1.3 己糖生物合成途径（HBP）
• 2 O-GlcNAc的检测方法
• 2.1 半乳糖基转移酶法检测末端O-GlcNAc
• 2.2 植物凝集素法检测末端O-GlcNAc
• 2.3 抗体法检测末端O-GlcNAc
• 2.4 化学方法检测末端O-GlcNAc
• 2.5 QUIC-Tag法检测末端O-GlcNAc
• 3 O-GlcNAc与磷酸化的关系
• 4 O-GlcNAc对蛋白质功能的调节
• 4.1 转录调节
• 4.2 蛋白质的降解
• 4.3 蛋白质的定位
• 4.4 蛋白质的相互作用
• 5 O-GlcNAc与信号转导
• 6 O-GlcNAc的生物学功能
• 6.1 O-GlcNAc与细胞生存
• 6.2 O-GlcNAc与细胞周期
• 6.3 O-GlcNAc与细胞营养感应
• 6.4 O-GlcNAc与细胞压力
• 7 O-GlcNAc与疾病
• 7.1 O-GlcNAc与糖尿病
• 7.2 O-GlcNAc与神经退行性疾病
• 7.3 O-GlcNAc与肿瘤
• 第二章 O-GlcNAc在乳腺癌转移过程中的作用
• 第一节 O-GlcNAc抑制和升高乳腺癌细胞模型的建立
• 1 实验材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 菌种和载体
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要试剂的配制
• 1.5 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 小鼠 OGT shRNA 载体的构建
• 2.1.1 小鼠 OGT shRNA 干扰片段的设计
• 2.1.2 DNA 寡核苷酸片段的退火
• 2.1.3 碱裂解法制备质粒 DNA
• 2.1.4 pLKO.1-puro 质粒的双酶切
• 2.1.5 目的 DNA 片段的回收
• 2.1.6 连接
• 2.1.7 转化
• 2.1.8 阳性克隆的筛选鉴定
• 2.2 OGT 基因沉默乳腺癌细胞株的构建
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 慢病毒的制备
• 2.2.3 慢病毒感染和细胞筛选实验
• 2.2.4 总 RNA 的制备（Trizol 法）
• 2.2.5 反转录 PCR（RT-PCR）制备cDNA
• 2.2.6 实时荧光定量 PCR
• 2.2.7 免疫印迹（Western blotting，WB）
• 2.3 乳腺癌细胞中 OGA 活性的抑制
• 3 实验结果
• 3.1 OGT 基因沉默载体的构建
• 3.2 OGT 基因沉默细胞株的构建
• 3.3 实时荧光定量 PCR 检测 OGT 的表达量
• 3.4 WB 检测 OGT 的表达量
• 3.5 OGT 沉默对 O-GlcNAc 的影响
• 3.6 PUGNAC 处理对 O-GlcNAc 的影响
• 4 小结
• 5 讨论
• 第二节 O-GlcNAc 在乳腺癌发生和发展过程中的作用
• 1 实验材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 MTT 法检测细胞增殖
• 2.2 细胞计数法检测细胞生长曲线
• 2.3 细胞锚定非依赖性生长实验
• 2.4 细胞迁移实验
• 2.5 体内肿瘤形成和转移实验
• 2.6 数据分析
• 3 实验结果
• 3.1 O-GlcNAc 对乳腺癌细胞增殖的影响
• 3.2 O-GlcNAc 对乳腺癌细胞锚定非依赖性生长能力的影响
• 3.3 O-GlcNAc 对乳腺癌细胞迁移能力的影响
• 3.4 O-GlcNAc对乳腺癌细胞肿瘤形成能力的影响
• 3.5 O-GlcNAc对乳腺癌肺转移的影响
• 4 小结
• 5 讨论
• 第三章 E-cadherin 在O-GlcNAc 介导的乳腺癌迁移过程中的作用
• 第一节 O-GlcNAc 对E-cadherin 表达和分布的影响
• 1 实验材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 载体
• 1.4 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 细胞间黏附能力的检测
• 2.2 实时荧光定量 PCR
• 2.3 蛋白稳定性实验
• 2.4 细胞骨架结合蛋白的提取
• 2.5 细胞膜蛋白的提取
• 2.6 免疫沉淀和免疫印迹
• 2.7 sWGA-agarose 亲和沉淀糖基化蛋白
• 2.8 激光共聚焦显微镜分析实验
• 2.9 数据分析
• 3 实验结果
• 3.1 O-GlcNAc 对乳腺癌细胞间黏附的影响
• 3.2 O-GlcNAc 对 E-cadherin 和β-catenin 表达的影响
• 3.3 O-GlcNAc 对 E-cadherin 和β-catenin 膜分布的影响
• 3.4 O-GlcNAc 对细胞骨架结合的 E-cadherin 和β-catenin 的影响
• 3.5 O-GlcNAc 对 E-cadherin 转录的影响
• 3.6 O-GlcNAc 对 E-cadherin 蛋白稳定性的影响
• 3.7 O-GlcNAc 对 E-cadherin 和β-catenin 相互作用的影响
• 3.8 O-GlcNAc 对 E-cadherinβ-catenin 和p120 的修饰
• 4 小结
• 5 讨论
• 第二节 E-cadherin 在O-GlcNAc 促进乳腺癌细胞迁移过程中的作用
• 1 实验材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 载体
• 2 实验方法
• 2.1 载体的构建
• 2.2 细胞株的构建
• 2.3 免疫印迹实验
• 2.4 细胞迁移实验
• 3 实验结果
• 3.1 pLKO.1-hygro 载体的构建
• 3.2 小鼠E-cadherin shRNA表达载体的构建
• 3.3 E-cadherin 沉默细胞株的构建
• 3.4 OGT 基因和 E-cadherin 基因双沉默细胞株的构建
• 3.5 E-cadherin 沉默对乳腺癌细胞迁移的影响
• 3.6 E-cadherin 在 O-GlcNAc 介导的乳腺癌细胞迁移过程中的作用
• 3.7 E-cadherin 在 O-GlcNAc 介导的乳腺癌细胞转移过程中的作用
• 4 小结
• 5 讨论
• 第四章 MAPK 信号在O-GlcNAc 介导的乳腺癌细胞迁移过程中的作用
• 1 实验材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 MAPK 活性（磷酸化）的检测
• 2.2 PD98059 对 MAPK 活性抑制实验
• 2.3 PD98059 对细胞迁移的影响
• 2.4 WB检测MAPK通路对E-cadherin表达的影响
• 2.5 免疫荧光检测 MAPK 通路对 E-cadherin 表达和分布的影响
• 3 实验结果
• 3.1 O-GlcNAc 对 MAPK 信号的调节作用
• 3.2 MAPK 通路在 O-GlcNAc 介导的乳腺癌细胞迁移过程中的作用
• 3.3 MAPK 通路与 E-cadherin 的相互影响
• 4 小结
• 5 讨论
• 参考文献
• 结论与创新
• 缩略词
• 致谢
• 发表的学术论文