论文摘要
目前关于动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）发病机制的研究中,占主导地位的是由R.Ross提出的又不断加以修正的“损伤—反应假说”（theResponse-to-Injury Hypothesis）和“炎症假说”（the Inflammaion Hypothesis）。两假说均认为血管内皮细胞（endothelial cells,EC）损伤、血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMC）增殖在AS发生中起着关键作用,其中内皮细胞损伤被认为是AS病灶形成的始动环节。在假说的论述中一直未提及外膜在AS病灶形成和发展中的作用。传统上认为外膜只是血管外周一层松散的结缔组织,仅仅对滋养血管和交感神经末梢起支持作用。因为其明显的边缘位置使血管外膜一直未成为人们关注的焦点。血管外膜特别是成纤维细胞在AS病灶形成和发展中的作用也不甚明了。近年来,对于血管外膜究竟是心血管病变中无作用的旁观者还是积极的参与者逐渐引起研究者的重视。有研究资料提示血管外膜通过直接或间接作用对血管的结构和功能调节起着重要的调控作用。成纤维细胞作为血管外膜最主要的细胞类型,在血管病变过程中表现出组织学、生物化学和功能特性的变化,以调节血管对损伤和应激的反应能力。1962年Schwart和Mitchell对随机选择的111例35岁以上的男性和女性的440张组织切片进行研究,结果发现血管外膜炎症程度与AS病变程度成正相关,并对血管外膜炎细胞的浸润程度进行了分级。KimRayner则在基因水平上进一步阐明外膜炎症对AS病灶形成的影响。他用原位杂交方法连续观察高脂喂养0—12周载脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein Eknockout,apoE（-/-））小鼠主动脉切片,发现在AS病灶形成中,单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1,JE/MCP-1）及其受体C-C趋化受体2（C-C chemokine receptor—2,CCR-2）的mRNA表达最早见于外膜的间质细胞,随后才出现大量表达MCP-1的巨噬细胞。从而提示在内膜损伤之前外膜中即有炎细胞的浸润。Mori等将MCP-1突变基因转染至球囊损伤的兔颈动脉局部骨骼肌后发现转染抑制了MCP-1介导的炎症反应,外膜巨噬细胞的聚集被显著抑制,外膜纤维化程度减轻,从而使病理性血管重塑减弱。有报道血管外膜细胞外基质的组成成分在AS和再狭窄的过程中也发生改变。Durmowicz等观察到血管外膜胶原和弹性蛋白产生和积聚在肺动脉高压进程中显著增加。Zalewski报告冠状动脉球囊成形术后先有外膜成纤维细胞的增殖,然后转化为肌成纤维细胞（myofibroblast,MF）迁移到新生内膜。而且在颈动脉动—静脉移植中,外膜成纤维细胞的增生、向肌成纤维细胞的转化、向新生内膜的迁移都早于新生内膜的增生。但是在这些相关研究报道中多数认为血管外膜炎症及其他外膜的反应都是AS等心血管疾病的晚期病理变化。国内外关于血管外膜参与AS病灶形成尤其是早期病灶形成的报道也非常少。我实验室在前期研究工作中发现apoE（-/-）小鼠冠状动脉（coronaryartery,CA）主干和心肌内CA小分支部分外膜区域有炎性细胞聚集,从而诱发该段AS病灶形成和延伸。目的:为进一步探讨血管外膜在AS病灶形成和进展中的作用,本课题拟通过整体动物实验研究aopE（-/-）小鼠血管外膜尤其是外膜成纤维细胞在AS发展的不同阶段在表型转化、增殖、迁移、胶原合成和各种细胞因子表达水平的动态变化,进一步更加系统地研究血管外膜特别是成纤维细胞激活与AS病灶形成和发展的关系。另外,我们亦通过体外培养apoE（-/-）小鼠血管外膜成纤维细胞,观察其与对照组野生型C57BL/6小鼠在细胞表型、功能特性和基因表达谱的差异,从中选择差异基因进行分析,进一步系统探讨血管外膜成纤维细胞参与AS病灶形成的机制。因血管外膜的特殊位置,可以从中选取兴趣基因以外膜为作用靶点进行基因治疗,从而为AS的治疗开辟新的途径,同时也为我们提出假说—血管外膜成纤维细胞激活,促使早期动脉粥样硬化病灶形成及病灶的进展提供试验依据。本课题将分以下三个部分进行研究和讨论:第一部分:整体动物实验研究血管外膜激活在AS病灶形成及发展中的作用方法:选择6周龄apoE-/-小鼠和野生型C57BL/6小鼠,分别给予高脂饲料（基础饲料84.75%、饱和脂肪15%、胆固醇0.25%）0、2、4、和8周。在各个时间点处死动物前24小时经腹腔注射5—溴—2—脱氧尿嘧啶（BrdU）,选取升主动脉制备连续切片。部分切片进行HE及Movat染色,以观察组织形态学的变化并测量外膜厚度的变化。部分切片行天狼猩红染色,偏振光分析Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原分布和含量的变化。用免疫组化方法观察不同阶段血管外膜和内膜α平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle-actin,α-SM-actin）、波形蛋白（vimentin）、结蛋白（desmin）、BrdU、MCP-1、细胞间黏附分子-1（intercellular adhesionmolecule-1,ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（Vascular cell adhesionmolecule-1,VCAM-1）、转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）及p47phox等细胞因子表达水平的动态变化。用荧光原位杂交技术检测JE/MCP-1mRNA的表达。结果显示:1.apoE（-/-）小鼠血管外膜厚度随着高脂喂养时间延长逐渐增加。其在高脂喂养4周后动脉内膜出现泡沫细胞,高脂喂养8周后内膜AS病灶进一步发展。而C57BL/6小鼠血管外膜厚度在高脂喂养的各个时间点没有显著变化,而且也未观察到内膜损伤的任何迹象。2.高脂喂养2周、4周后的apoE（-/-）小鼠外膜细胞检测到少量α-SM-actin的阳性表达,8W后几乎无α-SM-actin的表达,desmin始终呈阴性,大部分细胞呈现vimentin阳性,显示检测细胞为成纤维细胞,并表现出转化为肌成纤维细胞的特性。C57BL/6小鼠血管外膜始终未检测到α-SM-actin的阳性表达。3.apoE（-/-）小鼠随着高脂喂养时间延长,主动脉外膜胶原含量增加,均高于对照组C57BL/6小鼠。高脂喂养前及2周后,主动脉外膜胶原主要为Ⅲ型胶原,而高脂喂养4周,8周后,Ⅰ型胶原所占比例增加。而C57BL/6小鼠在高脂喂养前后主动脉外膜胶原合成无显著性变化。4.6周龄apoE（-/-）小鼠高脂喂养2周后,在无可见内膜病灶形成之前,首先在主动脉外膜发现BrdU阳性细胞,之后才在损伤内膜观察到BrdU标记细胞。而C57BL/6小鼠高脂喂养前后并未检测到BrdU标记的细胞。5.apoE（-/-）小鼠在内膜没有任何病灶形成之前,外膜已经检测到MCP-1mRNA及蛋白,TGF-β1,p47phox,VCAM-1的表达,随着高脂喂养时间增加,主动脉外膜滋养血管内膜ICAM-1的表达也增加。在C57BL/6小鼠主动脉外膜也检测到ICAM-1的表达,但其表达量少且稳定,各时间点之间无明显变化,另外其主动脉外膜也有极少量p47phox表达,但高脂喂养前后并没有显著变化。结论:1.在apoE（-/-）小鼠动脉粥样硬化病灶出现之前,动脉外膜首先被激活,其主要表现是成纤维细胞激活,并促使病灶的形成和进展。2.在高脂血症等危险因素作用下,在动脉内膜病灶形成之前,动脉外膜成纤维细胞表现出转化为肌成纤维细胞的特性、合成胶原纤维增多、增殖活性增强、合成和释放活性细胞因子增多。3.在高脂血症等危险因素作用下,在动脉内膜病灶形成之前,外膜滋养血管黏附分子表达增多,这也是外膜激活的表现之一。4.氧化应激既是血管外膜成纤维细胞激活的原因之一,又是成纤维细胞激活后通过旁分泌和自分泌方式,促进病灶形成和发展的重要机理之一。5.动脉外膜炎症是动脉粥样硬化病灶形成和发展过程中的早期事件之一。第二部分:体外培养血管外膜成纤维细胞研究其在AS病灶形成及发展中的作用方法:取6周龄apoE（-/-）小鼠和野生型C57BL/6小鼠,在高脂2周后用组织块法体外培养血管外膜成纤维细胞,取3～7代细胞用于实验。用免疫荧光法检测vimentin、desmin和α-SM-actin的表达,结合透射电镜观察细胞表型变化。用羟脯氨酸测试盒测定胶原合成情况。分别用CCK-8测试盒及BrdU掺入法测定细胞增殖活性的变化,流式细胞PI染色测定细胞周期。用插入式Transwell小室检测细胞的迁移能力。NADPH氧化酶活性检测试剂盒及超氧阴离子检测试剂盒检测细胞NADPH氧化酶活性及超氧阴离子的生成。应用NADPH氧化酶的特异性抑制剂DPI作用于细胞然后再检测细胞的增殖和迁移活性,观察NADPH氧化酶对成纤维细胞增殖和迁移活性的影响。采用基因芯片技术观察细胞基因表达谱的差异,然后用RT-PCR和Western-blot在mRNA和蛋白水平上进一步验证部分差异基因。将p47phox基因的Stealth siRNA,转染apoE（-/-）小鼠血管外膜成纤维细胞,观察其对apoE（-/-）小鼠血管外膜成纤维细胞NADPH氧化酶的抑制作用及其对细胞增殖和迁移活性的阻断效应。结果显示:1.两组小鼠培养血管外膜细胞均呈现vimentin（+）,desmin（-）,表现出典型成纤维细胞的特征。apoE（-/-）小鼠有少量细胞表现为α-SM-actin阳性,有部分超微结构发生改变,可见肌丝明显增多。而C57BL/6小鼠培养细胞未检测到α-SM-actin的阳性表达,超微结构也无明显变化。2.apoE（-/-）小鼠血管外膜成纤维细胞合成胶原量高于C57BL/6小鼠,两组之间有显著性差异。3.血清浓度为5%,10%,20%时,apoE（-/-）小鼠血管外膜成纤维细胞增殖活性明显高于C57BL/6小鼠,BrdU掺入法也得到相同结果。apoE（-/-）小鼠血管外膜成纤维细胞S期及G2/M期所占百分比明显高于对照组C57BL/6小鼠。4.apoE（-/-）小鼠与C57BL/6小鼠相比,培养的外膜成纤维细胞迁移到Transwell小室下室的细胞数明显增多,两组之间有显著性差异。5.apoE（-/-）小鼠较C57BL/6小鼠血管外膜成纤维细胞NADPH氧化酶活性增加,超氧阴离子生成增多,两组间有显著性差异。6.应用NADPH氧化酶的特异性抑制剂DPI作用于细胞可明显降低培养细胞NADPH氧化酶活性,减少超氧阴离子生成,apoE（-/-）小鼠细胞增殖和迁移活性受到显著抑制。7.apoE（-/-）小鼠和C57BL/6小鼠成纤维细胞基因芯片检测结果显示:apoE（-/-）小鼠成纤维细胞中癌基因如Rab3a、Rab1、Fyn、c-Met等,生长因子如PDGF、FGF、TGF等,炎性因子如IL-4、Tnfsf等,趋化因子如MCP-5、CCR-2、CCR-5等,黏附分子如ICAM-2、Itga3、CD36等,细胞外基质如collagen、Fbn2、TN-C、Fibulin4等,还有一些酶类如Noxol、Mapk、Prkcbpl等基因都是上调的;而凋亡相关基因、抑癌基因都是下调的。差异表达基因主要与细胞生长,氧化应激,信号转导,炎症,细胞黏附等生物过程有关。8.apoE（-/-）小鼠成纤维细胞collagenⅠ、collagenⅢ、TGF-β1、MCP-1、CCR-2、PDGF-b及p47phox的mRNA水平都明显高于对照组小鼠。TGF-β1、MCP-1、PDGF-b及p47phox的蛋白表达水平与RT-PCR结果是相一致的,明显高于对照组小鼠。9.转染apoE（-/-）小鼠成纤维细胞p47phox Stealth siRNA（MSS206956）48h后可有效抑制p47phox基因的表达,抑制NADPH氧化酶的活性,并可显著减轻成纤维细胞的增殖和迁移活性。结论:1.apoE（-/-）小鼠与C57BL/6小鼠的成纤维细胞相比,部分转化为肌成纤维细胞。2.apoE（-/-）小鼠与C57BL/6小鼠成纤维细胞相比表现出更强的增殖、迁移活性、NADPH氧化酶活性、胶原合成能力和释放活性细胞因子的能力。3.氧化应激参与外膜成纤维细胞的激活,激活的成纤维细胞又通过NADPH氧化酶活性增强生成更多的氧自由基,促进成纤维细胞的增殖及迁移活性。4.动脉外膜成纤维细胞NADPH氧化酶亚组分p47phox可作为动脉粥样硬化基因治疗的靶点。第三部分:提出新的假说根据整体动物实验,体外实验的实验证据,我们提出一个新的假说—血管外膜成纤维细胞激活,促使早期动脉粥样硬化病灶形成及病灶的进展。这将是对损伤—反应假说和炎症假说的一个补充。