论文摘要
空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是近年越来越受到发达国家重视的食源性致病微生物，所引起的急性腹泻发病数呈较快上升趋势。随着近年我国城镇居民物质生活水平的快速提高，各种禽肉类和奶类食品在膳食中所占比例不断加大，因食用被空肠弯曲菌污染的食物而导致的急性腹泻也越来越多。传统细菌学检测方法在检测空肠弯曲菌时存在诸多不足或缺陷，为了探索并建立检测空肠弯曲菌的快速检测方法，初步开展江苏地区的空肠弯曲菌污染状况的监测，进行本研究。目的：建立快速检测鉴别食品中的空肠弯曲菌的Multiplex PCR方法，并推广应用于日常检测，初步了解南京地区市售禽肉类食品中空肠弯曲菌的污染状况。方法：根据Gene bank中所载空肠弯曲菌hipO、mapA、23S rRNA等基因序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6引物辅助设计软件设计了多对特异性引物，经过反复验证筛选出最佳引物组合，然后对引物浓度、Mg2+浓度、退火温度、dNTP浓度等反应条件进行优化，最终建立从食品中快速检测鉴别空肠弯曲菌的Multiplex PCR方法。结果：1．经过多次采用空肠弯曲菌标准株、结肠弯曲菌标准株及其它常见肠道致病菌标准株的特异性试验，证明本Multiplex PCR方法的特异性较强，仅在空肠弯曲菌可同时扩增出3条特异性片段，在结肠弯曲菌时仅可扩增出1条弯曲菌属的特异性片段，而在其它各种肠道致病菌均无任何片段扩出。2．经过多次采用空肠弯曲菌标准株10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的梯度稀释菌液同时进行培养计数试验和PCR扩增，证明本Multiplex PCR方法的检测灵敏度在15CFU左右，优于传统细菌学方法的45CFU。3．从2005年9月份至2006年6月份，在食源性致病菌污染状况的日常监测中，从南京市区各菜场共采得各种禽肉类样品290份，然后分别用空肠弯曲菌国家标准检验方法和Multiplex PCR方法进行检测。结果显示：传统国家标准检测方法共检出空肠弯曲菌48株，污染率为16.6％；Multiplex PCR方法共检出空肠弯曲菌110株，污染率为37.9％。再次证明了Multiplex PCR方法检测空肠弯曲菌的灵敏度和结果均优于传统检测方法。结论：Multiplex PCR方法用于检测食品中的空肠弯曲菌时检测周期短，灵敏度高，特异度好，操作简便易于推广，且对检测仪器要求不高，可以作为进一步开展食品中空肠弯曲菌污染状况的监测和控制的技术基础。经过对食品中空肠弯曲菌污染状况一段时间地初步监测了解到南京地区市售禽肉类食品中空肠弯曲菌的污染率在37.9％左右，为进一步开展食品中空肠弯曲菌污染状况的监测和控制积累了数据基础。