论文摘要
背景与目的β-珠蛋白生成障碍性贫血（β-thalassemia,β-地贫）是一种常见的单基因遗传病,是由于β-珠蛋白基因突变或缺失,使β-珠蛋白链合成障碍,导致相对过剩的α-肽链形成包涵体沉积于细胞膜上,引起红细胞变形能力下降,在脾脏内被大量破坏所致的一组遗传性溶血性疾病。β-地贫发病率高、危害大,目前尚缺乏安全、有效、易行的治疗方法。γ珠蛋白基因诱导剂可以激活红系细胞中已基本关闭的γ珠蛋白基因,合成的γ链与相对过剩的α链构成胎儿血红蛋白（fetalhemoglobin,HbF）,降低α链与非α链之间的不平衡,减轻α链包涵体所致的原位溶血,从而改善临床症状。1982年国外首次报告应用5-氮杂胞苷（5-azacytidine,5-AZAC）治疗β-地贫患者取得较好疗效之后,陆续发现了多种γ珠蛋白基因诱导剂,如羟基脲（hydroxyurea,HU）、促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）、阿糖胞苷（cytarabine）、长春新碱（vincristine）、曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）、丁酸盐（butyrate）、地西他滨（decitabine）等。但是,目前这些药物的临床应用也受到诸多因素的限制,被美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准应用于临床的药物只有HU,但是仍有25%的病人对HU治疗没有反应。因此,急待开发更为安全有效的治疗β-地贫的新药。20多年来,制约γ珠蛋白基因诱导药物发展的主要瓶颈是对γ珠蛋白基因表达调控机制的了解尚不够充分。近年的研究表明细胞信号转导通路在药物介导的HbF合成过程中有重要作用,尤其是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinases,MAPKs）通路。p38 MAPK是MAPKs家族中的重要成员,蛋白激酶C、受体酪氨酸激酶、肿瘤坏死因子、紫外线和一些药物等能够激活p38MAPK信号途径,引起细胞内蛋白激酶的连锁反应,从而影响细胞的转录、蛋白合成和细胞表面受体表达等生物效应。研究显示HU、TSA、MS-275、沙利度胺（thalidomide）、scriptaid等都可以通过p38MAPK信号转导通路诱导γ珠蛋白基因转录。本课题组通过高表达p38磷酸化的细胞模型也证明了p38信号通路持续活化可直接激活γ珠蛋白基因的转录并促进HbF的合成。黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根,其性甘、微温,入肺、脾经,具有补气升阳、固表止汗、托毒排脓、利水消肿、敛疮生肌等功能。黄芪多糖（Astragalus polysaccharides,APS）是黄芪的主要生物活性成分之一,体内外实验及临床研究表明,APS具有刺激造血的作用,可以提高红系集落形成单位（colony-forming unit-erythroid,CFU-E）和红系爆式集落形成单位（burst formingunits-erythroid,BFU-E）的形成率,从而增加红细胞数量与血红蛋白量。本课题组前期的研究结果证明APS不仅可诱导K562细胞红系分化,而且可增加γ珠蛋白基因表达和HbF合成,但是其作用机制不明。本研究旨在探讨p38MAPK在APS诱导γ珠蛋白基因表达中的作用,实验以人红白血病细胞系K562细胞为模型,通过RT-PCR、Western blotting和联苯胺染色技术分析APS作用于K562细胞后p38磷酸化与γ珠蛋白基因表达的关系,研究结果将阐明p38MAPK信号通路在γ珠蛋白基因表达中的作用,为γ珠蛋白基因表达调控机制提供新的实验依据,为APS的临床应用提供理论基础,为研发安全有效新药提供有价值的分子靶点。方法:1.药物制备及细胞培养:用超声醇提水提法提取APS,苯酚—硫酸法定量后过滤备用。以K562细胞为体外模型,APS诱导的K562细胞为实验组,0.5mmol/L丁酸钠（Na-butyrate,NaB）诱导48h的K562细胞为阳性对照,K562亲本细胞为空白对照组。2.通过Western blotting技术检测APS诱导K562细胞后磷酸化p38/p38表达。2.1剂量效应:用150mg/L、300m/L、450mg/L APS诱导K562细胞,48h分别提取总蛋白检测p38磷酸化水平。2.2时间效应:300mg/L APS诱导K562细胞,分别在3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h收集细胞提取总蛋白检测p38磷酸化水平。2.3 SB203580对p38磷酸化增强的抑制作用:以10μmol/L的p38MAPK特异抑制剂SB203580预处理1h后再用300mg/L APS处理K562细胞,48h提取总蛋白检测p38磷酸化水平。3.采用RT-PCR技术分析APS诱导K562细胞后p38磷酸化水平与Aγ和Gγ珠蛋白基因mRNA表达之间的关系。4.应用Western blotting技术分析APS诱导K562细胞后p38磷酸化水平与HbF表达之间的关系。5.采用联苯胺染色定性技术分析APS诱导K562细胞后p38磷酸化水平与K562细胞红系分化之间的关系。6.统计学方法:实验数据均以均数±标准差（（?）±SD）表示,使用SPSS 11.5 forWindows软件包进行单向方差分析（One-Way ANOVA）。多重比较采用LSD（Least-significant-Difference）检验。P＜0.05表示差异有显著性。结果:1.APS对K562细胞p38磷酸化的作用:1.1 Western blotting分析p38磷酸化水平结果显示APS可以诱导K562细胞p38磷酸化增强,可达空白对照组的5.18±0.13倍（P=0.000）,诱导前后p38磷酸化水平差异有显著性意义。1.2剂量效应:150mg/L、300mg/L、450mg/LAPS均可诱导K562细胞磷酸化p38增强,分别为K562亲本细胞的3.24±0.20倍、5.18±0.13倍和3.49±0.25倍（F=305.146,P=0.000）,以300mg/LAPS诱导时p38磷酸化水平最高（P＜0.001）,诱导前后p38磷酸化水平差异有显著性意义。1.3时间效应:结果显示各时间点之间p38磷酸化水平不同（F=399.72,P=0.000）,与K562亲本细胞相比,磷酸化p38水平在6h开始上升,48～60h达峰值,为K562亲本细胞的4.10±0.09倍,以后开始下降（P＜0.001）,差异有显著性意义,且峰值与NaB组（4.25±0.13倍）相比差异无显著性意义（P=0.076）。1.4 SB203580对APS诱导p38磷酸化的抑制作用:药物诱导K562细胞前加SB203580与未加SB203580组间磷酸化p38水平不同（F=933.503,P=0.000）。加SB203580预处理组APS诱导p38磷酸化减弱,由未加SB203580组的4.10±0.09倍下降为1.59±0.12倍（P=0.000）,抑制率为80.97%;同样,加SB203580预处理组NaB诱导p38磷酸化减弱,由未加SB203580组的4.25±0.13倍下降为1.45±0.04倍（P=0.000）,抑制率为86.15%:加与未加SB203580预处理组间p38磷酸化强度差异有显著性意义。2.APS诱导K562细胞后p38磷酸化水平与γ珠蛋白基因表达的关系:2.1 APS诱导K562细胞后p38磷酸化增强对γ珠蛋白基因表达的诱导作用。2.1.1 RT-PCR结果示:APS诱导K562细胞后Aγ（F=134.602,P=0.000）和Gγ（F=505.453,P=0.000）珠蛋白基因mRNA水平均增加,分别为K562亲本细胞的4.37±0.35倍（P=0.000）和5.23±0.28倍（P=0.000）,诱导前后差异有显著性意义;NaB组则分别4.50±0.14倍（P=0.000）和6.52±0.25倍（P=0.000）,诱导前后差异有显著性意义。2.1.2 Western Blotting检测APS诱导K562细胞后HbF表达量增加表达量增加（F=736.199,P=0.000）,为K562亲本细胞的6.41±0.27倍（P=0.000）,NaB诱导后为7.10±0.10倍（P=0.000）,药物诱导前后HbF表达量差异有显著性意义。2.1.3联苯胺染色结果提示APS诱导后联苯胺染色阳性率（BZ%）增加（F=67.278,P=0.000）,48h后为15.67%,NaB诱导后为19.60%,与K562亲本细胞（3.47%）相比差异均有显著性意义（P＜0.001）。2.2 SB203580对APS诱导K562细胞γ珠蛋白基因表达的抑制作用:2.2.1 RT-PCR结果提示用药前加SB203580预处理后APS诱导K562细胞的Aγ和Gγ珠蛋白基因mRNA水平均下降,分别由未用SB203580预处理组的4.37±0.35倍和5.23±0.28倍下降为2.28±0.09倍和1.75±0.19倍（P＜0.001）,抑制率分别为62.02%和82.27%;NaB组Aγ和Gγ珠蛋白基因mRNA水平由4.50±0.14倍和6.52±0.25倍分别下降为2.61±0.30倍和1.58±0.10倍（P≤0.004）,抑制率分别为54.00%和89.50%,用药前用与未用SB203580预处理组间Aγ和Gγ珠蛋白基因mRNA水平差别有显著性意义。2.2.2 Western blotting结果显示用药前加SB203580预处理后APS和NaB诱导K562细胞的HbF表达量下降,分别由未加SB203580预处理组的6.41±0.27倍和7.10±0.10倍下降为1.84±0.15倍和1.58±0.27倍（P＜0.001）,用SB203580预处理后抑制率分别为84.47%和90.49%,用与未用SB203580预处理组间HbF表达量差异有显著性意义。2.2.3联苯胺染色结果显示用药前加入SB203580预处理后APS和NaB诱导K562细胞的BZ%下降,分别由未加SB203580预处理组的15.67%和19.60%下降为3.93%（P=0.733）和4.00%（P=0.697）,抑制率分别为96.23%和96.71%,加与未加SB 203580预处理组间BZ%差异有显著性意义。结论:1.首次实验证明APS可以诱导K562细胞P38磷酸化增强,且存在剂量效应和时间效应:150～450mg/LAPS均可诱导K562细胞P38磷酸化增强,300mg/L为最佳诱导浓度:磷酸化p38水平在6h开始上升,48～60h达峰值,以后开始下降。SB203580可以抑制APS对K562细胞P38磷酸化的增强作用。2.首次实验证明p38MAPK信号通路在APS诱导γ珠蛋白基因表达、HbF合成和K562细胞红系分化中起重要作用。3.研究结果为阐明p38MAPK信号通路在药物诱导γ珠蛋白基因表达中的作用提供新的科学依据,为APS的临床应用提供理论基础,为今后研发新药提供有价值的分子靶点。
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