O-GlcNAc修饰在结肠癌形成和迁移过程中的作用

论文摘要

氧连接的β-N-乙酰葡萄糖胺修饰（O-GlcNAc）是一种广泛存在于细胞浆和细胞核蛋白质丝氨酸和苏氨酸上的动态、可逆的翻译后修饰,与经典的糖基化修饰不同,而类似于磷酸化。介导O-GlcNAc基团添加和移除的酶分别是O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase,OGT）和O-GlcNAc水解酶（O-GlcNAcase,OGA）。通过快速可逆的动态调节,O-GlcNAc修饰可以调控众多细胞核和细胞质蛋白的生物学功能,参与基因转录、信号转导、代谢等多种细胞生命活动的调控。不仅如此,近年来的很多研究结果表明,O-GlcNAc修饰的异常与糖尿病、癌症、神经退行性疾病等人类重大疾病密切相关。然而,在O-GlcNAc修饰与癌症的研究领域,虽然目前已发现多种肿瘤相关蛋白（如p53、c-myc等）存在O-GlcNAc修饰,但是O-GlcNAc对肿瘤发生和发展过程的影响作用尚待深入探究。本实验室的前期研究工作已经证明,O-GlcNAc修饰能促进乳腺癌的侵袭转移;本文检测了O-GlcNAc修饰在结肠癌、肝癌和胰腺癌组织中的表达,并研究了O-GlcNAc修饰在结肠癌细胞HT29发生和侵袭过程中的作用。本论文应用免疫组化技术检测了结肠癌、肝癌和胰腺癌组织样本（各31对）,比较癌组织与癌旁组织中O-GlcNAc修饰水平的差异,实验结果显示,结肠癌组织中的O-GlcNAc修饰水平高于对应癌旁组织,而肝癌与胰腺癌组织则无明显差异。为了探讨结肠癌中O-GlcNAc修饰增加的机制,我们进一步检测了结肠癌组织与癌旁组织中OGA和OGT的差异表达,结果表明结肠癌组织中OGT蛋白表达量显著增加而OGA没有明显变化。为了进一步研究O-GlcNAc修饰在结肠癌发生发展过程中的作用,我们又构建了O-GlcNAc修饰水平升高和降低的HT29结肠癌细胞模型,并检测其恶性度的变化。应用RNA干扰技术对HT29细胞中的OGT表达进行高效、稳定的沉默,获得O-GlcNAc修饰水平降低的结肠癌细胞模型;使用糖苷酶OGA的特异性抑制剂Thiamet-G处理细胞,得到O-GlcNAc修饰水平升高的结肠癌细胞模型。MTT法实验证明,O-GlcNAc修饰不影响HT29细胞的增殖能力;软琼脂克隆形成实验证明,OGT沉默可以抑制HT29细胞的锚定非依赖性生长能力,而Thiamet-G处理则可促进其锚定非依赖性生长能力;Transwell小室实验证明,OGT沉默或Thiamet-G处理对HT29细胞的迁移能力没有显著影响。这些结果表明,O-GlcNAc修饰可以影响结肠癌细胞HT29的克隆形成能力,但是对其增殖和迁移能力没有显著影响。综上所述,本论文利用免疫组化技术在组织水平检测了结肠癌、肝癌和胰腺癌中O-GlcNAc修饰水平,首次证明结肠癌中O-GlcNAc修饰水平增加;利于分子生物学和细胞生物学的方法证明了O-GlcNAc修饰对结肠癌细胞HT29的增殖、克隆形成和迁移能力的影响。本文的研究不仅对阐明O-GlcNAc修饰在肿瘤发生和发展过程中的作用具有重要的理论意义,而且为O-GlcNAc修饰作为临床诊断和治疗的新靶点提供了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 O-GlcNAc 修饰
• 1.1 O-GlcNAc 修饰的生物合成
• 1.1.1 O-GlcNAc 糖基转移酶（OGT）
• 1.1.2 O-GlcNAc 糖苷酶（OGA）
• 1.1.3 己糖胺合成途径
• 1.2 O-GlcNAc 修饰与磷酸化
• 1.3 O-GlcNAc 修饰的生物学功能
• 1.3.1 O-GlcNAc 修饰与细胞周期和生存
• 1.3.2 O-GlcNAc 修饰与细胞压力应激
• 1.4 O-GlcNAc 修饰与疾病
• 1.4.1 O-GlcNAc 修饰与糖尿病
• 1.4.2 O-GlcNAc 修饰与神经退行性疾病
• 1.4.3 O-GlcNAc 修饰与心血管系统疾病
• 1.4.4 O-GlcNAc 修饰与癌症
• 2 组织芯片
• 2.1 组织芯片的原理
• 2.2 组织芯片的分类
• 2.3 组织芯片的制备流程
• 2.4 组织芯片的应用
• 第一章 组织芯片
• 1 实验材料
• 1.1 组织芯片
• 1.2 实验试剂
• 1.3 常用溶液的配制
• 2 主要仪器
• 3 实验方法
• 3.1 免疫组化步骤
• 3.2 染色强度计算方法
• 4 实验结果
• 4.1 人的结肠癌、肝癌和胰腺癌与癌旁组织中O-GlcNAc 修饰的检测
• 4.2 人的结肠癌与癌旁组织中OGT、OGA 表达量的检测
• 5 小结
• 6 讨论
• 第二章 O-GlcNAc 修饰在结肠癌细胞迁移过程中的作用
• 第一节 构建 O-GlcNAc 修饰水平降低和升高的细胞模型
• 1 实验材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 菌种与病毒载体
• 1.3 实验试剂
• 1.4 实验溶液配制
• 2 仪器与设备
• 3 实验方法
• 3.1 构建O-GlcNAc 修饰水平降低的细胞模型
• 3.1.1 人OGT shRNA 载体的构建
• 3.1.1.1 设计人类OGT shRNA 片段序列
• 3.1.1.2 制备DNA 寡核苷酸片段
• 3.1.1.3 碱裂解法提取pLKO.1-puro 质粒
• 3.1.1.4 质粒pLKO.1-puro 双酶切
• 3.1.1.5 目的片段胶回收
• 3.1.1.6 DNA 片段与pLKO.1-puro 载体连接
• 3.1.1.7 制备感受态细胞及质粒转化
• 3.1.1.8 阳性克隆菌株的筛选鉴定
• 3.1.2 构建OGT 基因沉默的结肠癌细胞株
• 3.1.2.1 细胞冻存与复苏
• 3.1.2.2 细胞传代和培养
• 3.1.2.3 制备慢病毒
• 3.1.2.4 慢病毒感染细胞及筛选
• 3.1.2.5 Trizol 法抽提细胞总RNA
• 3.1.2.6 反转录PCR 制备cDNA
• 3.1.2.7 实时荧光定量PCR
• 3.1.2.8 免疫印迹实验（Western Blot, WB）
• 3.2 构建O-GlcNAc 修饰水平升高的细胞模型
• 4 实验结果
• 4.1 构建OGT 基因沉默载体
• 4.2 筛选OGT 基因沉默细胞株
• 4.3 实时荧光定量PCR 检测OGT mRNA 的表达
• 4.4 免疫印迹法检测OGT 蛋白表达量
• 4.5 OGT 沉默对HT29 细胞O-GlcNAc 修饰水平的影响
• 4.6 Thiamet-G 处理对HT29 细胞O-GlcNAc 修饰水平的影响
• 5 小结
• 6 讨论
• 第二节 O-GlcNAc 修饰对结肠癌细胞 HT29 的生物学特性的影响
• 1 实验材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 实验试剂
• 2 仪器与设备
• 3 实验方法
• 3.1 MTT 法检测细胞增殖能力
• 3.2 细胞锚定非依赖性生长实验
• 3.3 细胞迁移实验（Transwell 法）
• 3.4 数据的统计处理
• 4 实验结果
• 4.1 O-GlcNAc 修饰对结肠癌细胞HT29 增殖的影响
• 4.2 O-GlcNAc 对结肠癌细胞锚定非依赖性生长能力的影响
• 4.3 O-GlcNAc 对结肠癌细胞迁移能力的影响
• 5 小结
• 6 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 在读期间的学术成果