花特异表达启动子调控ACC氧化酶基因RNAi载体构建及转化拟南芥

论文摘要

百合（LiLium spp.）是世界主要的切花品种之一,但是百合花期短,影响它的观赏价值和瓶插寿命,因此培育花期较长的百合新品种非常重要。研究结果表明:百合为乙烯释放型花卉,百合花朵开放时,伴随着乙烯的释放而衰老。ACC氧化酶（ACC oxidase）是催化乙烯生成的最后一步关键酶,控制着乙烯的生成速率。因此,通过RNA干扰技术可使内源ACC氧化酶基因转录的mRNA被降解,对ACC氧化酶基因进行有效沉默,抑制乙烯生成,达到延长花期的目的。在本课题组前期已克隆获得百合查尔酮合成酶（chalcone synthase）基因启动子序列和百合ACC氧化酶基因序列的基础上,本研究取得的主要结果如下:1、构建了植物中间表达载体pCAM-CHSA分别以chsA-F、chsA-R和tNOS-F、tNOS-R为引物, pCHS和pBin19为模板进行PCR扩增花特异表达启动子和终止子,得到的目的基因片段克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒pCHS-T和pNOS-T。对载体pCAMBIA 1300和载体pPZP-RCS进行Hind III和EcoR I双酶切,对pCAMBIA1300载体进行改造,将pPZP-RCS的多酶切位点构建到pCAMBIA 1300上,得到重组质粒pCAM-PZP。将启动子片段和终止子片段分别克隆进pCAM-PZP,得到含有花特异表达启动子的植物中间表达载体pCAM-CHSA。2、构建了花特异表达启动子调控的ACC氧化酶基因RANi载体pCAM-ACOi分别以ACOZ-F、ACOZ-R和ACOF-F、ACOF-R为引物,以pACO为模版进行PCR扩增,将ACC氧化酶正、反义基因片段克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒pACOZ-T和pACOF-T。分别将pACOZ-T、pACOF-T克隆进辅助载体pAUX3131、pAUX3166,得到重组质粒pAU-ACOZ和pAU-ACOF。再将重组质粒上的目的基因克隆到植物中间表达载体pCAM-CHS上,最终获得了花特异表达启动子调控的ACC氧化酶基因RNAi载体。3、转化拟南芥并进行了PCR检测通过Floral Dip法转化拟南芥,经潮霉素抗性筛选,获得阳性植株20株。采用CTAB法提取DNA,用潮霉素基因和根据ACC氧化酶RNAi载体设计特异引物进行了PCR检测,转化植株的DNA扩增出了潮霉素基因和目的基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 乙烯与切花衰老的关系
• 1.1.1 乙烯与切花衰老
• 1.1.2 乙烯的生物合成
• 1.1.3 ACC 氧化酶基因研究
• 1.1.4 ACC 氧化酶基因生物技术育种研究
• 1.2 植物启动子的研究进展
• 1.2.1 启动子概念
• 1.2.2 启动子结构及功能
• 1.2.3 启动子的分类
• 1.3 RNA 干扰
• 1.3.1 RNA 干扰的发现
• 1.3.2 RNA 干扰的定义及特征
• 1.3.3 RNA 干扰的作用机制
• 1.3.4 RNA 干扰在植物中的应用
• 1.4 本研究的目的意义
• 第二章 试验部分
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌种及载体
• 2.1.3 试剂药品
• 2.1.4 培养基
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 拟南芥植株的培养
• 2.2.2 植物中间表达载体的构建
• 2.2.3 花特异表达启动子调控的ACC 氧化酶基因RNAi 载体的构建
• 2.2.4 pCAM-ACOi 质粒导入农杆菌菌株及其检测
• 2.2.5 花序浸润法转化拟南芥
• 2.2.6 抗生素筛选及移栽
• 2.2.7 拟南芥DNA 提取
• 2.2.8 转基因植株的PCR 检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 植物中间表达载体的构建
• 2.3.2 花特异表达启动子调控的ACC 氧化酶基因RNAi 载体构建
• 2.3.3 根癌农杆菌的转化及鉴定
• 2.3.4 花序浸润法转化拟南芥及抗性筛选
• 2.3.5 拟南芥PCR 检测
• 第三章 讨论与结论
• 3.1 讨论
• 3.1.1 组成型启动子调控ACC 氧化酶的RNAi 载体转化百合的研究
• 3.1.2 植物干扰载体的构建
• 3.1.3 转基因植株检测及下一步需要开展的研究
• 3.2 结论
• 3.2.1 构建了植物中间表达载体
• 3.2.2 构建了花特异表达启动子调控的ACC 氧化酶基因RANi 载体
• 3.2.3 转化拟南芥并进行PCR 检测
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介