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应用单雌系F2代法监测田间棉铃虫种群对转Bt基因棉的抗性

2020-12-06阅读(305)

应用单雌系F2代法监测田间棉铃虫种群对转Bt基因棉的抗性

论文摘要

表达CrylAc毒蛋白的转Bt基因棉花在中国北方地区种植多年,虽然Bt棉因其高效和对环境低风险迅速受到种植者的青睐,但是如此商业化大面积推广使用Bt棉将会增加靶标害虫对Bt棉产生抗性的风险,室内研究已经表明棉铃虫能对CrylAc毒素和Bt棉产生高抗性。在中国河北邱县地区,1998年开始推广种植Bt棉,1999年采用单雌系F2代法检测到邱县地区田间棉铃虫野生种群对Bt棉初始抗性等位基因频率达到了0.0058。考虑到棉铃虫在如此高的抗性初始频率值和持续的田间选择压情况下,有可能对Bt棉产生抗性风险。2003-2007年在前人研究的基础上,我们采用单雌系F2代法、剂量反应法、F1代法和DNA分子生物学方法相结合的综合抗性监（检）测体系,研究长期大面积种植转Bt基因棉地区棉铃虫田间种群对Bt棉的抗性发展趋势,为设计制定合理有效的抗性治理策略提供及时、准确的科学依据,以延长转Bt基因棉在大田的使用。2003-2005年采用Bt棉株作为筛选媒介,对河北邱县（2003-2005年）和威县（2004年）地区田间棉铃虫种群进行单雌系F2代法抗性监测。结果表明,这两个地区3年监测的340对单雌系中有20对被确定为携带有对Bt棉抗性的等位基因,棉铃虫种群的抗性等位基因频率（E（q））范围为0.0119-0.0297。其中邱县地区连续3年监测到的棉铃虫对Bt棉的平均抗性等位基因频率值（E（q））为0.0146（95%CI=0.0084-0.0225）,明显高于1999年的监测结果（p=0.042）;2003-2005年分别监测了105对、42对和131对单雌系,平均每个单雌系在Bt棉株上分别处理筛选了372.4±16.0头、328.1±9.5头和314.0±9.0头F2代初孵幼虫,最终分别有4对、4对和7对单雌系被确定为田间亲本携带有抗性基因的阳性反应单雌系,每年的抗性等位基因频率值分别为0.0119（95%CI=0.0039-0.0243）、0.0297（95%CI=0.0099-0.0606）和0.0154（95%CI=0.0067-0.0277）,监测处理单雌系的总抗性等位基因检出累计概率值(1-PNO)分别为96%、97%和94%;威县地区2004年共筛选了62对单雌系,平均每个单雌系筛选了334.7±8.6头F2代初孵幼虫,最终有5个单雌系被确定田间亲本携带有抗性基因,抗性等位基因频率值为0.0243（95%CI=0.0091-0.0471）,单雌系总的抗性等位基因检出累计概率值(1-PNO)为95%。结果表明威县地区棉铃虫野生种群对Bt棉的抗性等位基因频率值处在一个较高的阈值,并且超过了高剂量/庇护区策略的要求。采用Bt棉叶喂饲法处理室内敏感、抗性及两者杂交后代的初孵幼虫,通过四者在转基因棉花上5天生长发育速率的不同来加以区分。试验结果表明,敏感与抗性品系棉铃虫在Bt棉上5天的存活率与生长发育速率存在明显差异,敏感幼虫不能在转Bt基因棉叶上存活,抗性品系在转Bt基因棉叶上处理5天的存活率达到75%,正反交的幼虫存活率仅为2-6%.棉铃虫抗性品系存活幼虫中65%个体在Bt棉上发育到2龄中期、0.6mg以上;而杂合子和敏感纯合子存活幼虫均达不到此生长发育速率。因此可以确定棉铃虫幼虫在Bt棉上5天发育到2龄中期以上、体重≥0.6mg的个体为抗性个体。2006-2007年改进单雌系F2代法,采用Bt棉叶作为筛选媒介进行邱县田间棉铃虫抗性监测。2006年和2007年共筛选了134对和137对单雌系,平均每个单雌系分别筛选了187.9±3.4头和105.1±1.5头F2代初孵幼虫,抗性等位基因频率值分别为0.1135（95%CI=0.0862-0.1449）和0.0745（95%CI=0.0532-0.0995）,2006年和2007年单雌系总的抗性等位基因检出累计概率值(1-PNo)分别为95%和90%。2007年,采用大田雄虫与室内抗性雌虫杂交的F1代法监测邱县棉铃虫抗性等位基因频率,共筛选了135对单雌系,平均每个单雌系筛选了165.2±5.2头F1代初孵幼虫,经过F2代核查后最终确定有29对单雌系的田间亲本携带有抗性基因,抗性等位基因频率值为0.107（95%CI=0.055-0.159）。2003-2007年,采用剂量反应法监测邱县、威县地区棉铃虫种群对CrylAc毒蛋白的抗性水平。5年的研究结果显示,田间棉铃虫对CrylAc毒蛋白的抗性倍数分别为15.3、12.9、12.5、6.7、16.5和11.5,基本达到了中等水平抗性。2006-2007年,将单雌系F2代法确定为携带有对Bt棉抗性等位基因的田间亲本提取基因组DNA,利用根据室内抗性和敏感棉铃虫钙粘素受体基因序列设计的三个引物对田间抗性棉铃虫进行PASA分子检测,探索性的研究这三个引物在田间抗性检测中的应用。2006年共检测了50头田间亲本成虫,2007年共检测了44头田间亲本成虫。结果显示,根据室内抗、敏棉铃虫钙粘素受体基因设计的PASA引物无法有效的应用于田间棉铃虫Bt抗性检测,田间Bt抗性分子检测技术还有待进一步的改进。通过长达5年的田间抗性监测研究发现,邱县等大面积种植表达单一CrylAc毒蛋白Bt棉的地区,田间棉铃虫种群对Bt棉的抗性等位基因频率已经显著上升,证实了害虫抗药性发展模式中,在初始抗性等位基因频率值较高（＞0.005）地区的害虫,对Bt棉的抗性发展较快的这一推论。类似于邱县作物种植种类和结构的地区需要采取有效、灵敏的抗性检测与监测体系进行害虫的Bt抗性研究,同时结合田间生态环境,建立合理、有效的抗性管理策略,从而延长转Bt基因作物的应用。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 符号及缩写语说明
  • 第一章 文献综述
  • 1.苏云金芽孢杆菌（Bt）
  • 1.1 苏云金芽孢杆菌概述（Bacillus thuringiensis,简称Bt）
  • 1.2 杀虫晶体蛋白ICPs
  • 1.3 Bt杀虫晶体蛋白的作用机理
  • 2.Bt 的应用
  • 2.1 Bt杀虫基因的研究
  • 2.2 转Bt基因作物的种植应用
  • 3 害虫对Bt的抗性研究进展
  • 3.1 害虫对Bt抗性的室内研究进展
  • 3.2 害虫对Bt抗性的田间研究进展
  • 3.3 害虫对Bt的抗性机理研究
  • 3.3.1 氨肽酶-N（aminopeptidase-N,APN-N）
  • 3.3.2 类钙粘蛋白（Cadherin-Like Protein）
  • 3.3.3 糖脂类（glycolipids）
  • 4.害虫对转Bt基因作物的抗性检测和监测
  • 4.1 生物测定方法
  • 4.1.1 剂量—反应检测技术
  • 4.1.2 区分剂量法
  • 1代单雌系筛选法'>4.1.3 F1代单雌系筛选法
  • 1代检测法（大田雄虫与室内护雌虫杂交F1代检测法，简称F1代法）'>4.1.4 用室内已知抗性种群单对交配的F1代检测法（大田雄虫与室内护雌虫杂交F1代检测法，简称F1代法）
  • 2代筛选法（简称单雌系F2代法）'>4.1.5 单雌系F2代筛选法（简称单雌系F2代法）
  • 4.1.6 田间诱集区直接检测法
  • 4.1.7 田间调查加室内生测法
  • 4.2 抗性基因分子检测技术
  • 5.害虫对Bt作物抗性的治理策略
  • 5.1 基因策略
  • 5.2 田间抗性治理策略
  • 5.2.1 高剂量/庇护区策略
  • 5.2.2 合理轮作等田间措施
  • 6.本研究立题依据、目的与意义
  • 2代法监测田间棉铃虫对Bt棉的抗性等位基因频率'>第二章 2003年-2005年单雌系F2代法监测田间棉铃虫对Bt棉的抗性等位基因频率
  • 1.材料与方法
  • 1.1 供试棉铃虫
  • 1.2 供试棉花
  • 2代法监测棉铃虫对Bt棉抗性等位基因频率'>1.3 单雌系F2代法监测棉铃虫对Bt棉抗性等位基因频率
  • 2代法原理'>1.3.1 单雌系F2代法原理
  • 1.3.2 田间棉铃虫种群抗性等位基因频率监测
  • 1.3.3 抗性等位基因频率值的计算
  • 2.结果与分析
  • 2.1 2003年棉铃虫种群抗性基因频率监测结果
  • 2.2 2004年棉铃虫种群抗性基因频率监测结果
  • 2.2.1 河北邱县Bt棉区棉铃虫种群抗性基因频率监测结果
  • 2.2.2 河北威县Bt棉区棉铃虫种群抗性基因频率监测结果
  • 2.4 2005年棉铃虫种群抗性基因频率监测结果
  • 3.讨论
  • 第三章 抗性棉铃虫生长发育速率标准的研究
  • 1.材料与方法
  • 1.1供试棉铃虫
  • 1.2 供试棉花
  • 1.3 供试试剂与仪器
  • 1.4 抗性棉铃虫生长发育速率标准的研究
  • 1.4.1 抗性棉铃虫生长发育速率标准的建立
  • 1.4.2 抗性棉铃虫生长发育速率标准的验证
  • 1.4.3 采用等位基因特异性PCR技术（PASA）对抗性棉铃虫进行验证
  • 1.4.3.1 PASA基本原理
  • 1.4.3.2 DNA提取
  • 1.4.3.3 目的基因PCR扩增、回收、测序
  • 2.结果与分析
  • 2.1 抗性棉铃虫生长发育速率标准
  • 2.2 抗性棉铃虫生长发育速率标准的验证
  • 2.2.1 采用遗传回交方法验证抗性棉铃虫
  • 2.2.2 采用分子法验证抗性棉铃虫
  • 3.讨论
  • 第四章 2006年—2007年河北Bt棉田棉铃虫对Bt作物的抗性监测
  • 1.材料与方法
  • 1.1 供试棉铃虫
  • 1.2 供试棉花
  • 2代法监测棉铃虫抗性等位基因频率'>1.3 单雌系F2代法监测棉铃虫抗性等位基因频率
  • 2代法原理'>1.3.1 单雌系F2代法原理
  • 2代饲养'>1.3.2 2006—2007年田间成虫采集及F2代饲养
  • 2代法抗性监测（叶片喂饲法）'>1.3.3 田间棉铃虫单雌系F2代法抗性监测（叶片喂饲法）
  • 1.3.4 抗性等位基因频率值的计算方法
  • 1代检测法（简称F1代法）'>1.4 用室内已知的抗性种群单对交配的F1代检测法（简称F1代法）
  • 1代法原理'>1.4.1 F1代法原理
  • 1代饲养'>1.4.2 2007年田间雄虫采集及F1代饲养
  • 1代法抗性监测（叶片喂饲法）'>1.4.3 田间棉铃虫F1代法抗性监测（叶片喂饲法）
  • 1代抗性棉铃虫核查'>1.4.4 F1代抗性棉铃虫核查
  • 1.5 DNA分子技术（PASA法）应用于田间棉铃虫Bt抗性检测研究初探
  • 2 结果与分析
  • 2代法抗性基因频率监测结果'>2.1 2006年河北邱县棉铃虫单雌系F2代法抗性基因频率监测结果
  • 2代法抗性基因频率监测结果'>2.2 2007年河北邱县棉铃虫单雌系F2代法抗性基因频率监测结果
  • 1代法抗性基因频率监测结果'>2.3 2007年河北邱县棉铃虫F1代法抗性基因频率监测结果
  • 2.4 DNA分子技术（PASA法）应用于田间棉铃虫对Bt抗性检测研究初探
  • 3.讨论
  • 第五章 转Bt基因棉田棉铃虫对CrylAc毒蛋白抗性监测
  • 1.材料与方法
  • 1.1 供试棉铃虫
  • 1.2 供试试剂和仪器
  • 1.2.1 供试药剂
  • 1.2.2 试验器具
  • 1.3 试验方法
  • 2.结果与分析
  • 3.讨论
  • 全文主要结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文

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