不同物种液泡型Na～+/H～+逆向运转体基因的克隆及盐、干旱胁迫下的功能比较

论文摘要

盐、干旱胁迫在全世界范围内严重影响作物产量,利用基因工程提高植物抗盐碱、耐干旱能力,培育出能适合在盐碱土地上生长的植物品种是有效利用盐渍化土地的主要方法。在盐胁迫环境中,植物细胞的离子平衡受到迫害,尤其是胞质中过多的Na+,对植物细胞的代谢产生毒害。植物获得耐盐能力的一个重要策略是建立新的离子平衡。离子平衡涉及Na+的吸收、外排、区隔化和长距离转运。植物液泡膜Na+/H+逆向运转体蛋白能利用液泡膜上的H+-ATPase和H+-PPiase所产生的质子动力势将Na+区隔化在液泡内。这不仅能降低细胞质内的Na+浓度,还可以有效地利用储存在液泡内的Na+作为渗透剂。在多种植物中过量表达液泡膜Na+/H+逆向运转蛋白基因都明显提高了转基因植物的耐盐性,说明液泡膜Na+/H+逆向运转蛋白基因在植物的耐盐性中起着重要的作用。本研究分别从棉花、酵母、拟南芥、小麦以及碱蓬中分离出液泡膜Na+/H+逆向运转体蛋白基因,对这些基因在盐和干旱条件下的功能做了全面的分析和比较,主要结果和结论如下:1、利用GenBank中的序列设计特异引物,通过RT-PCR的方法分别从棉花、酵母、拟南芥、小麦、碱蓬中克隆得到Na+/H+逆向运转体蛋白基因,分别是GhNHX1（GhN1）、ScNHX1（ScN1）、AtNHX1（AtN1）、TaNHX1（TaN1）、SsNHX1（SsN1）。2、同源序列比较及聚类分析发现,来源于棉花、拟南芥、小麦、碱蓬的液泡型Na+/H+逆向运转体蛋白基因的序列高度同源,与酵母液泡型Na+/H+逆向运转体蛋白基因的序列同源性较低。其中属于双子叶植物的棉花、拟南芥和碱蓬的GhN1、AtN1和SsN1亲缘关系较近;而小麦属于单子叶植物,TaN1与来源于大麦的HvNHX1和来源于长穗燕麦草的HeNHX1亲缘关系较近;但单子叶植物与双子叶植物的亲缘关系则较低。3、GhN1、ScN1、AtN1、TaN1、SsN1对酵母液泡型Na+/H+逆向运转体突变体的互补实验表明GhN1、ScN1、AtN1、TaN1、SsN1均能够部分恢复酵母液泡型Na+/H+逆向运转体突变体的耐盐性,但不同来源的基因对酵母突变体耐盐性恢复的程度不尽相同,其中AtN1对酵母突变体的耐盐性恢复的程度最高,其次为SsN1、ScN1、GhN1,而TaN1对酵母突变体的耐盐性恢复的程度最低。4、构建植物表达载体pBI121-NHX1后利用农杆菌侵染的方法将基因GhN1、ScN1、AtN1、TaN1、SsN1分别转入拟南芥和烟草,Northern杂交结果表明GhN1、ScN1、AtN1、TaN1、SsN1基因均已经在各个转基因拟南芥植株中表达。在200mM NaCl胁迫处理以及干旱处理下,野生型植株逐渐枯萎甚至死亡,而各种转基因植株均能较为正常的生长,但生长的状况有很大差异,其中转TaN1的植株在盐胁迫下植株较小,叶片发黄,部分植株枯萎;而转SsN1的植株在盐胁迫下植株生长状况良好,叶片生长紧凑,贴地生长,叶片呈明显的暗绿色。叶绿素含量测定表明转基因植株的叶绿素含量明显高于野生型,转SsN1基因的植株在盐胁迫处理以及干旱处理后叶绿素含量明显增高。在盐胁迫下转基因拟南芥的光合速率和叶绿素荧光Fv/Fm虽然都下降,但仍明显高于野生型;在转基因植株中,转小麦TaN1基因的植株光合速率下降的最多;而转碱篷SsN1基因的植株在处理10天光合速率比5天时有所回升,而其它转基因植株的光合速率一直是下降的。盐胁迫下野生型植株的膨压几乎为零,转TaN1的植株膨压较低,稍高于野生型,转其他基因的植株的膨压均接近于正常生长水平。植物鲜重测定结果表明不同来源的液泡型Na+/H+逆向运转体基因均能提高拟南芥的耐盐能力,但提高程度存在明显差异。因此,SsN1和GhN1对提高植物的耐盐抗旱性作用相对较强、AtN1和ScN1的作用居中,而TaN1的作用最小。干旱胁迫处理后对野生型及转基因植株进行叶绿素含量、Fv/Fm以及水势和渗透势的测定,结果分析表明干旱胁迫与盐胁迫的结果一致。5、对基因GhN1、SsN1的3’端分别进行缺失（缺失序列分别为:279bp,编码93个氨基酸;285bp,编码95个氨基酸）,构建酵母表达载体,将GhN1?3’和SsN1?3’互补酵母液泡型Na+/H+逆向运转体突变体,结果表明,缺失掉C端亲水区域后的蛋白依然能够部分恢复突变体的耐盐性,并且恢复程度与全长蛋白相比略有提高。6、用棉花液泡型逆向运转体蛋白GhN1的N末端40个氨基酸、C末端109个氨基酸分别做诱饵筛选棉花叶片cDNA文库,共得到约20个克隆,经重新验证活性后,选择结合活性较强的12个克隆测序（其中用N端为诱饵筛选的克隆是2个,用C端为诱饵筛选的克隆是10个）。GenBank中Blast结果发现这些克隆与拟南芥基因组中的同类基因有较高同源性。对其中的11个克隆进行RT-PCR,结果表明在200mM NaCl处理12 h后,基因A11、A14、B10和B14的表达量上升;基因A1的表达量降低;基因A3、A5、C3、C8、N5和N14的表达量基本不变。在100μM ABA处理6 h后,基因A1、A11、A14和B10的表达量上升;基因A5、C3、C8和N14的表达量下降;基因A3、B14和N5的表达量基本不变。说明有些基因能响应盐胁迫和ABA,可能在棉花的耐盐性和ABA信号途径中有重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 植物的耐盐性
• 1.1.1 盐胁迫对植物的危害
• +毒性的主要基础'>1.1.2 Na⁺毒性的主要基础
• 1.1.3 植物的耐盐机制
• 1.2 耐盐基因和耐盐基因工程
• 1.3 植物的抗旱性
• 1.3.1 植物耐旱机制
• 1.3.2 植物耐旱的基因工程
• +/H⁺逆向运转蛋白'>1.4 Na⁺/H⁺逆向运转蛋白
• +/H⁺逆向运转蛋白的结构特征'>1.4.1 Na⁺/H⁺逆向运转蛋白的结构特征
• +/H⁺逆向转运蛋白的功能'>1.4.2 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的功能
• 1.5 酵母双杂交
• 1.5.1 酵母双杂交技术的原理
• 1.5.2 酵母双杂交系统构成
• 1.5.3 酵母双杂交体系的应用
• 1.5.4 酵母双杂交体系的优点及一些注意的问题
• 1.6 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酵母菌株和载体
• 2.1.4 酶及生化试剂
• 2.1.5 实验引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RNA 提取
• 2.2.2 RNA 纯化
• 2.2.3 cDNA 第一条链的合成
• 2.2.4 目的基因GhN1、ScN1、AtN1、TaN1、SsN1 的分离
• 2.2.5 GhN1、SsN1 基因3’末端的缺失
• 2.2.6 DNA 片断与克隆载体的连接
• 2.2.7 大肠杆菌DH5α感受态的制备
• 2.2.8 大肠杆菌细胞的转化
• 2.2.9 序列测定
• 2.2.10 质粒DNA 的提取
• 2.2.11 凝胶电泳中DNA 片段的回收
• 2.2.12 Northern 杂交
• 2.2.13 酵母表达载体的构建与转化
• 2.2.14 酵母双杂交
• 2.2.15 植物正义表达载体的构建与转化
• 2.2.16 植物生理指标的测定
• 3 结果与分析
• +H⁺逆向运转体基因的分离及功能比较'>3.1 棉花、酵母、拟南芥、小麦、碱蓬液泡型Na⁺H⁺逆向运转体基因的分离及功能比较
• +H⁺逆向运转体基因的分离'>3.1.1 棉花、酵母、拟南芥、小麦、碱蓬液泡型Na⁺H⁺逆向运转体基因的分离
• +/H⁺逆向运转体基因同源性比较'>3.1.2 不同来源的Na⁺/H⁺逆向运转体基因同源性比较
• +H⁺逆向运转体基因的功能比较分析'>3.1.3 棉花、酵母、拟南芥、小麦、碱蓬液泡型Na⁺H⁺逆向运转体基因的功能比较分析
• 3.2 GhN1、SsN1 3’端缺失后基因功能的分析
• 3.2.1 GhN1、SsN1 基因3’端的缺失
• 3.2.2 GhN1、SsN1 3’端缺失基因在酵母突变体中的功能互补
• 3.2.3 GhN1、SsN1 3’端缺失基因在拟南芥中的表达分析
• 3.3 酵母双杂交筛选与GhN1 N、C 末端作用的蛋白
• 3.3.1 GhN1 N、C 末端序列的扩增
• 40aa和pGBKT7-GhNC_109aa 的构建'>3.3.2 诱饵载体pGBKT7-GhNN_40aa和pGBKT7-GhNC_109aa的构建
• 3.3.3 构建的诱饵蛋白不具备转录激活活性
• 3.3.4 诱饵蛋白对酵母细胞的生长没有影响
• 3.3.5 cDNA 文库的构建
• 3.3.6 用GhN1 N、C 末端分别作诱饵蛋白筛选cDNA 文库的结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢