普洱茶及黄杨类化合物诱导ALT肿瘤p16Ink4a基因去甲基化的研究

论文摘要

[目的]研究普洱茶及黄杨类化合物KBA02对ALT肿瘤细胞p16Ink4a基因启动子区去甲基化作用以及诱导过甲基化沉默的这一基因重新表达作用,并进一步探讨其去甲基化作用的机制,为开发靶抗肿瘤药物及应用普洱茶辅助治疗癌症提供理论依据,。[方法]采用细胞形态检测的方法观察细胞在普洱茶及黄杨类化合物KBA02处理前后的形态变化；采用结晶紫染色的方法检测细胞在不同浓度普洱茶及黄杨类化合物KBA02处理其增殖的差异。采用BSP（bisuLfate sequencing PCR）测序分析检测普洱茶及黄杨类化合物KBA02作用前后ALT肿瘤细胞p16Ink4a基因启动子区甲基化状态的变化情况；半定量逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）检测ALT肿瘤细胞经过不同浓度普洱茶及黄杨类化合物KBA02处理后p16Inka4a基因的mRNA的表达变化；用蛋白免疫印迹法（Western Blotting）检测ALT肿瘤细胞经过不同浓度普洱茶及黄杨类化合物KBA02处理后的p16Inak4a基因蛋白的表达变化；使用EpiQuik DNMT Activity/Inhibition Assay ULtra Kit这一DNMT酶活检测试剂盒检测普洱茶及黄杨类化合物KBA02作用前后ALT肿瘤细胞DNA甲基转移酶的活性变化。[结果]（1）0.1mg/mL、0.25mg/mL和0.5mg/mL的普洱茶处理ALT肿瘤细胞三天后,与空白对照相比仍贴壁的细胞呈体积增大、多角形、核大的表型,且随着普洱茶浓度的升高细胞逐渐大量抑制并且死亡,而用0.25mg/mL及其以上浓度的普洱茶处理WT细胞则停止增殖；用25uM和50uM的5-Aza-CdR处理ALT肿瘤细胞两天后,其形态更加的不规则且大量被杀死,而以处理ALT肿瘤细胞最高浓度50uM处理WT细胞三天后,WT细胞形态几乎不变；结晶紫染色检测也证明以上相同的结论。ALT肿瘤细胞在用l0uM的KBA02处理时与空白对照相比仍贴壁的细胞呈体积增大、多角形、核大的表型,并且细胞增殖被明显抑制并且死亡,在KBA02的浓度达20uM时ALT肿瘤细胞基本全部死亡；在KBA02的浓度高达30uM时WT细胞仍旧变化不明显,但有抑制的现象。MTT实验也证明以上相同的结论。（2） BSP（bisuLfate sequencing PCR）测序分析、RT-PCR、Western-blot以及EpiQuik DNMT Activity/Inhibition Assay ULtra Kit这一DNMT酶活检测试剂盒检测提示ALT肿瘤细胞p16Inak4a基因发生高甲基化而失活。一定浓度的普洱茶及黄杨类化合物KBA02作用于ALT肿瘤细胞一段时间后,各组的p16Ink4a基因的甲基化程度减弱,p16Ink4a基因的异常甲基化现象被逆转,沉默的p16Inka4a基因重新表达,并且呈明显的浓度和时间依赖性。最后证明普洱茶及黄杨类化合物KBA02通过抑制DMNT的活力来去甲基化。[结论])普洱茶及黄杨类化合物KBA02可能通过降低DNA甲基转移酶的活性从而诱导ALT肿瘤中p16Ink4a产生去甲基化,诱导沉默的p16Inak4a重新表达,从而间接证明普洱茶以及黄杨类化合物作为肿瘤辅助治疗物具有十分光明的前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 插图清单
• 第一章 前言
• 1.1 ALT肿瘤
• 1.2 DNA甲基化与肿瘤
• Ink4a基因甲基化与癌症'>1.3 p16^Ink4a基因甲基化与癌症
• 1.4 5-Aza-CdR去甲基化与肿瘤治疗
• 1.5 普洱茶及黄杨类化合物简介
• 1.6 本研究意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 主要实验试剂和仪器
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 实验流程图
• 2.3 试剂配置方法
• 2.4 实验方法
• Ink4a基因甲基化状态的测定'>2.4.1 小鼠ALT肿瘤的获得及其p16^Ink4a基因甲基化状态的测定
• 2.4.2 小鼠ALT肿瘤细胞及WT（野生型）细胞的培养
• 2.4.3 小鼠ALT肿瘤细胞及WT（野生型）细胞的复苏和冻存和传代
• 2.4.4 细胞计数
• 2.4.5 不同浓度的普洱茶、5-Aza-CdR及黄杨类化合物KBAO2等药物处理ALT肿瘤细胞及WT细胞后,观察细胞形态
• 2.4.6 结晶紫染色实验检测普洱茶对ALT肿瘤细胞及WT细胞的抑制情况
• 2.4.7 MTT实验检测黄杨类化合物KBAO2对ALT肿瘤细胞及WT细胞的抑制情况
• 2.4.8 用药物处理细胞一段时间后收集细胞沉淀
• 2.4.9 提取细胞沉淀中的DNA及DNA浓度和纯度的测定
• 2.4.10 基因组DNA的亚硫酸盐修饰和BSP（bisuLfate sequencingPCR）测序分析
• 2.4.11 TA克隆的连接与转化
• 2.4.12 菌落PCR与测序
• 2.4.13 总RNA提取及RNA酶污染的预防
• 2.4.14 RNA浓度和纯度的测定
• 2.4.15 cDNA第一链的合成
• 2.4.16 RT-PCR（real-time PCR）扩增
• Ink4a的蛋白表达水平'>2.4.17 Western blot检测普洱茶、5-Aza-CdR及黄杨类化合物KBAO2等药物处理细胞后p16^Ink4a的蛋白表达水平
• 2.4.18 普洱茶、5-Aza-CdR及黄杨类化合物KBAO2等药物处理肿瘤细胞后提取细胞核蛋白
• 2.4.19 普洱茶及5-Aza-CdR等药物处理肿瘤细胞后检测其DNMT活力
• 第三章 实验结果
• Ink4a基因甲基化状态'>3.1 ALT肿瘤细胞p16^Ink4a基因甲基化状态
• 3.2 不同浓度的普洱茶、黄杨类化合物KBAO2及5-Aza-CdR等药物抗ALT肿瘤效果
• 3.3 结晶紫染色实验检测普洱茶对ALT肿瘤细胞抑制
• 3.4 MTT实验检测黄杨类化合物KBAO2对ALT肿瘤细胞及WT细胞的抑制情况
• Ink4a基因启动子区附近甲基化模式的影响'>3.5 普洱茶及5-Aza-CdR等药物对ALT肿瘤细胞p16^Ink4a基因启动子区附近甲基化模式的影响
• Ink4a基因的mRNA转录水平的影响'>3.6 普洱茶、5-Aza-CdR及黄杨类化合物等药物对ALT肿瘤细胞p16^Ink4a基因的mRNA转录水平的影响
• Ink4a基因蛋白表达的影响'>3.7 普洱茶、5-Aza-CdR及黄杨类化合物等药物对ALT肿瘤细胞p16^Ink4a基因蛋白表达的影响
• 3.8 普洱茶、5-Aza-CdR及黄杨类化合物KBA02等药物对ALT肿瘤细胞DNMTs活力的影响
• 第四章 讨论
• 第五章 总结和展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录