论文摘要
第一部分过表达GDF-5基因大鼠脂肪干细胞构建的条件探索和筛选目的：探索慢病毒介导过表达GDF-5基因大鼠脂肪干细胞（ASCs）的构建条件和纯度筛选。方法：取大鼠腹股沟脂肪垫组织,采用Ⅰ型胶原酶消化贴壁培养方法分离培养大鼠ASCs。倒置相差显微镜观察培养细胞的形态学,CCK-8法测定细胞生长曲线,流式细胞仪进行细胞表型鉴定。制备带GDF-5/GFP嵌合基因的慢病毒载体系统,探索不同感染复数（MOI）（MOI=1,5,10,20,40,60,80,100）的转染效率,选择最佳转染复数,采用流式细胞仪检测转染效率。对转染细胞行流式细胞筛选,测定筛选后转染细胞的阳性率。筛选出的细胞行细胞爬片,DAPI染色,形态学上进一步验证细胞阳性率。并采用CCK-8法检测转染后细胞活力。结果：成功培养大鼠ASCs,流式细胞免疫表型鉴定：间充质干细胞表面抗原（CD90、CD29、CD44、CD105）表达阳性,造血细胞表面抗原（CD45、CD34）和骨髓干细胞表面抗原（CD106）表达阴性。成功构建GDF-5过表达慢病毒载体系统,慢病毒转染大鼠ASCs最佳MOI为40,转染率为65%。通过GFP荧光流式细胞筛选技术,可将转染细胞阳性率提高至96%。体外传代后阳性细胞率无明显减少。CCK-8法检测转染后细胞活力、生长曲线与未转染细胞无明显差异。结论：胶原酶消化法可成功培养大鼠ASCs。慢病毒介导GDF-5/GFP嵌合基因转染大鼠ASCs的最佳MOI为40,转染率为65%。流式细胞筛选技术可显著提高转染细胞阳性率,对细胞活力无显著影响。第二部分过表达GDF-5基因大鼠ASCs的鉴定和分化目的：评估转染GDF-5基因大鼠ASCs表达GDF-5基因、蛋白的有效性,并评估其能否向髓核样细胞分化。方法：收集筛选后GDF-5基因转染细胞,荧光定量Real-time PCR检测GDF-5基因表达情况,Western Blot检测检测GDF-5蛋白表达。收集GDF-5基因转染细胞培养上清液,Elisa检测上清液中GDF-5含量。细胞不添加额外诱导剂体外培养7天后,收集细胞行Real-time PCR检测髓核样细胞标记物Sox9、Collagen Ⅱ Aggrecan基因表达情况,Western Blot检测检测Sox9、Collagen Ⅱ、Aggrecan蛋白表达情况。比较GDF-5基因转染细胞与未转染细胞在上述基因和蛋白表达的差异,评估基因转染、蛋白表达的有效性,以及转染GDF-5基因ASCs是否能显著表达髓核样细胞标记物。对GDF-5基因转染后细胞的行细胞爬片,免疫荧光染色观察细胞内Sox9、Collagen Ⅱ、Aggrecan的表达和胞内定位。结果：GDF-5慢病毒转染组的基因和蛋白水平与空白对照组相比较均显著性增高（P<0.001）,说明目的基因转染有效。Elisa法检测细胞上清液中GDF-5含量为（151.7±33.2）ng/N,显著性高于空白对照组（P<0.001）。细胞培养7天后,Real-time PCR、Western Blot结果显示三种髓核样细胞标记物Sox9、ollagen Ⅱ、 Aggreca的基因和蛋白表达水平,GDF-5慢病毒转染组均显著性高于空白对照组,有统计学差异（P<0.001）。免疫细胞荧光从形态学上证明转染GDF-5的ASCs髓核细胞样标记物Sox9、Collagen Ⅱ、Aggrecan呈阳性表达。其中Sox9主要表达在细胞核、Collagen Ⅱ主要表达在胞质中,Aggrecan在胞质和细胞核中均有表达。结论：过表达GDF-5基因大鼠ASCs可有效表达GDF-5基因和蛋白,并能分泌至细胞外,且在不额外添加诱导剂的情况下能在基因、蛋白及形态学上向髓核样细胞分化。第三部分胶原修饰温致水凝胶的制备和生物相容性评估目的：制备Ⅱ型胶原修饰的温致水凝胶（Collagen/Hydrogels）,进行表征测定和评估其生物相容性。方法：采用开环聚合方法合成PCLA-PEG-PCLA三嵌段共聚物水凝胶,0.1%Ⅱ型胶原修饰后行钴60辐照灭菌,核磁共振及体积排除色谱测定辐照前后凝胶分子量,倒管法及流变仪测定相转变温度。测定修饰后前后凝胶的体外降解过程中的物理形貌及浸提液pH。MTT法测定凝胶包载细胞后的细胞活力,流式细胞仪Annexin V/PI法测定含修饰后凝胶培养液能否致使细胞凋亡或死亡。大鼠颈部皮下埋植检测其体内生物相容性。结果：采用开环聚合方法可成功合成PCLA-PEG-PCLA三嵌段共聚物水凝胶,Ⅱ型胶原修饰及钴60辐照灭菌后凝胶分子量无明显变化,对成胶温度无显著影响。胶原修饰后对凝胶形态学维持有所提高,降解产物浸提液的pH呈中性。MTT检测结果表明细胞在胶原修饰后凝胶中的活力相比在单纯凝胶中得到有效提高。流式细胞凋亡测试表明不同梯度的含胶原修饰后凝胶的培养液不会导致细胞凋亡或死亡。皮下埋植实验未见炎性细胞浸润,表明凝胶体内组织相容性好。结论：Ⅱ型胶原对PCLA-PEG-PCLA水凝胶支架进行修饰可提高其细胞粘附活性和增殖能力,对凝胶本身的温敏性无显著影响。修饰后的水凝胶具有良好的细胞相容性和组织相容性第四部分胶原修饰温致水凝胶包载过表达GDF-5脂肪干细胞修复大鼠椎间盘退变目的：评估胶原修饰温致水凝胶包载GDF-5基因转染脂肪干细胞（ASCs）修复大鼠椎间盘退变的效果。方法：采用胶原修饰温致水凝胶包载转染GDF-5脂肪干细胞（ASCs）包载移植细胞,X线透视下用21G穿刺针针刺大鼠尾椎纤维环至髓核中央,进行抽吸,在Co5/Co6、Co7/Co8、Co8/Co9间盘水平进行操作,Co6/Co7为正常对照。针刺后,Co5/Co6间盘通过微量注射器给予PBS2μl,作为阴性对照组。Co7/Co8、Co8/Co9间盘按不同处理措施分组如下：（1）ASCs-GDF5+Col/Gel组：胶原修饰水凝胶中包载GDF-5基因转染的大鼠ASCs;（2）ASCs-GDF5+Gel且：单纯水凝胶中包载GDF-5基因转染的大鼠ASCs;（3）ASCs-GDF5+PBS组：含GDF-5基因转染大鼠ASCs的PBS液；（4）ASCs+Col/Gel组：胶原修饰水凝胶中包载无GDF-5基因转染的大鼠ASCs;（5）ASCs+Gel组：单纯水凝胶中包载无GDF-5基因转染的大鼠ASCs;（6）ASCs+PBS组：含无DF-5基因转染大鼠ASCs的PBS液：（7）Col/Gel组：仅注射胶原修饰水凝胶；（8）Gel组：仅注射单纯水凝胶溶液。注射液体体积均为2μl。移植后每两周通过细胞自带GFP应该观察细胞存活情况。移植30天、60天、90天后行大鼠尾椎X线检查,计算并比较相对椎间隙指数（DHI（%））变化,并行HE染色、番红O-快绿染色、甲苯胺蓝梁色迸行组织学评估。结果：体内示踪表明移植后4周仍可观察到移植细胞GFP荧光,形态学上有分化。对同一时间点不同处理组DHI（%）比较:ASCs-GDF5+Col/Gel组、ASCs-GDF5+PBS组、ASCs+Col/Gel组在移植后三个时间点均显著高于PBS组（P<0.05）。移植后90天,ASCs-GDF5+Gel组、ASCs+PBS组的DHI（%）也均优于PBS组（P<0.05）。对同一处理组在不同时间点DHI（%）比较：ASCs-GDF5+Col/Gel组与ASCs+Col/Gel组移植90天后与移植30天相比DHI（%）均得到了一定提高,结果具有统计学意义（P<0.05）。ASCs-GDF5+Ge1组、ASCs-GDF5+PBS组及ASCs+PBS组在三个时间段中DHI（%）无显著性变化（P>0.05）,而ASCs+Gel组、Col/Gel组、Gel组及PBS组的DHI（%）在三个时间点呈下降趋势,结果有统计学差异（P<0.05）。阴性对照PBS组在针刺造模30天后椎间盘发生退变,说明椎间盘模型制备成功。HE组织学评分,在移植术后同一时间点中,ASCs-GDF5+Col/Gel组、ASCs-GDF5+Gel组、ASCs-GDF5+PBS组、ASCs+Col/Gel组的HE染色组织学评分结果要显著低于阴性对照PBS组,结果均有统计学差异（P<0.05）。在所有组别中ASCs-GDF5+Col/Gel组评分显著低于其他组（P<0.05）,修复效果椎间盘效果最为显著。ASCs-GDF5+Col/Gel组在移植后的三个时间点中,组织学评分无显著性升高（P>0.05）,而其它组在穿刺移植术后90天相比术后30天,组织学评分显著性升高（P<0.05）。所有组的间盘均未见炎性细胞浸润等急性或慢性炎症的组织学表现。结论：Ⅱ型胶原修饰的PCLA-PEG-PCLA水凝胶包载过表达GDF-5基因大鼠ASCs移植至椎间盘退变模型中细胞可继续存活、分化。Ⅱ型胶原修饰水凝胶包载大鼠ASCs和转GDF-5基因大鼠ASCs移植均可有效逆转或延缓大鼠尾椎间隙高度丢失,改善组织学评分,其中两者联用的Ⅱ型胶原修饰水凝胶包载转GDF-5基因大鼠ASCs移植修复效果最好。
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