稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

论文摘要

本研究将热酚水法提纯羊布鲁菌（16M菌株）的脂多糖（LPS）和灭活羊种布鲁菌（16M）作为免疫抗原,交替免疫6～8周龄Balb/c雌鼠。第一次免疫用羊种布鲁菌标准菌16M全菌加等量弗氏完全佐剂;第二次免疫用脂多糖加等量弗氏不完全佐剂。第三次免疫用羊种布鲁菌标准菌16M全菌（本次不加佐剂）;第四次用脂多糖（本次不加佐剂）,每次免疫间隔十天。四免后,测其ELISA效价达到1:10000以上的,用脂多糖（LPS）抗原腹腔超强免疫一次,三天后取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。用热酚水法提纯羊布鲁菌（16M菌株）的脂多糖作为包被抗原建立间接ELISA方法,筛选抗羊种布鲁菌（16M菌株）脂多糖的单克隆抗体杂交瘤细胞株。采用有限稀释法,经过3～4次克隆,最终获得12株分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为:4A11、6B8、3H7、4D4、3E3、3F9、6E3、6F2、2C3、5D11、4C3、5H3。经过亚类鉴定,其中3E3和6E3是IgG1亚类,3F9、2C3、5D11、3H7和4D4是IgG3亚类,4C3为IgG2a亚类,而6F2、5H3、6B8、4A11是IgM亚类。选择其中两株杂交瘤细胞（4D4和3H7）进行染色体分析,试验结果所得平均染色体数目在92～108之间,符合SP2/0细胞的染色体数目与正常小鼠脾细胞的染色体数目之和,表明所获得的抗体分泌细胞为杂交瘤细胞。对其中3株杂交瘤细胞（6B8、5H3和3H7）进行特异性检测,结果显示该3株单抗只与灭活的羊种布鲁菌16M裂解抗原发生反应,呈现阳性;而不与大肠杆菌O157裂解抗原、鸡白痢沙门菌裂解抗原、鸭源鸡杆菌1-S脂多糖抗原以及福氏志贺菌解抗原反应。虎红凝集试验和试管凝集试验进一步证实此3株单抗具有很强的特异性。经检测,所得12株抗羊种布鲁菌单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清ELISA效价在1:1000～1:10000之间,小鼠腹水单克隆抗体ELISA效价为1:160000。对其中5株杂交瘤细胞（6B8、3E3、3F9、6E3、6F2）进行连续传10、20、30代和3次冻融复苏后,杂交瘤细胞生长旺盛,虽然有部分杂交瘤细胞分泌抗体的能力有些轻微下降,但分泌抗体能力并没有消失,仍能稳定分泌高效价抗体,说明所获得的杂交瘤细胞株分泌抗体能力稳定。利用所建立的单克隆抗体细胞株,建立了一种检测布鲁菌的双夹心间接ELISA方法,并进行了特异性和敏感性检测。对模拟样品水样两份（S1、S2）、奶样两份（S3、S4）、土样两份（S5、S6）进行了检测,准确性均很高。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 布鲁菌病的研究进展
• 1.2 单克隆抗体的技术及应用
• 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 免疫抗原羊种布鲁菌16M 的制备
• 3.2 筛选抗原脂多糖的提纯方法及银染鉴定
• 3.3 间接ELISA 方法的建立
• 3.4 重复性实验结果
• 3.5 间接ELISA 的特异性实验
• 3.6 分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
• 3.7 抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体的部分性状鉴定
• 3.8 单抗介导双夹心间接ELISA 检测布鲁菌方法的建立
• 3.9 抗羊种布鲁菌脂多糖单抗的初步应用
• 4 结论与讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 英文摘要