论文摘要
高血压是一种全球性常见疾病,可导致脑血管、心脏和肾脏的病变,是严重危害人类健康的主要疾病之一。在我国,高血压的发病率也在逐年增加,血压升高已成为我国心血管病最重要的危险因素。近年随着对高血压发病机理的深入研究,证实血管重构是高血压病理改变的重要部分和高血压维持、恶化的结构基础,是高血压靶器官损害中的一种机制,与高血压及其并发症的发生、发展均密切相关。因此,逆转高血压血管重构已被认为是高血压病治疗措施中值得高度重视的一个组成部分。G蛋白在高血压及其血管重构的形成发展过程中扮演着非常重要的角色,本室曾针对G蛋白α亚单位的功能结构域,克隆了一种G蛋白抑制肽GCIP,并对其基因及蛋白结构进行了分子优化,优筛并合成了GCIP-27。已有的研究显示,GCIP-27对心肌重构有明显抑制作用。本研究拟通过在体和离体实验研究,评价GCIP-27对自发性高血压大鼠（SHR）主动脉重构和血压的影响,并初步探究其作用机制,为寻找有效的抗心肌重构、血管重构药物及新的治疗高血压等血管增生性疾病的药物靶点奠定实验基础。方法:1.用SHR作为实验动物模型,给予GCIP-27（7、20、60μg/kg,ip,bid）或氯沙坦（6 mg/kg,ig,o.d.）治疗8周,并设立Wistar正常对照和SHR模型组。2.大鼠血压的测定采用无创尾套法;主动脉重构的评价采用病理切片HE染色,图像分析测定大鼠主动脉血管中层壁厚（MT）和内径（LD）并计算二者比值（MT/LD）的方法;透射电镜观察大鼠主动脉超微结构的改变;免疫组织化学法测定大鼠主动脉PCNA表达。3.大鼠血管平滑肌细胞的原代培养采用组织贴块法,并用机械刮除法和差异贴壁法进行细胞纯化,用形态学观察和α-SM–actin免疫细胞化学法进行细胞鉴定。4.GCIP-27对SHR血管平滑肌细胞增殖肥大影响的评价分别采用3H-TdR和3H-Leu掺入法测定DNA和蛋白合成速率。5.用1μmol/L的Ang II诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖,不同浓度的GCIP-27（1μg/L～10 mg/L）进行干预,对大鼠血管平滑肌细胞增殖的评价采用MTT比色法、细胞计数法和Bradford法分别测定细胞增殖活度、细胞数目及总蛋白含量。6.对GCIP-27机制的探究采用Fluo-3/AM负载、激光共聚焦显微镜扫描法测定[Ca2+]i;采用免疫细胞化学法测定p-ERK1/2蛋白表达量。结果:1. GCIP-27对SHR主动脉重构和血压的影响（1） SHR的收缩压明显高于正常,7、20、60μg/kg的GCIP-27治疗8周后均能明显降低SHR的收缩压（p<0.05或p<0.01）,但其降压效果远不如6 mg/kg的氯沙坦,60μg/kg的GCIP-27降压效果仅为后者的61.8%。（2） SHR胸主动脉有明显的重构现象,中层壁厚（MT）明显增加,管腔内径（LD）明显增大,而MT/LD比值也明显增大（p<0.01）,细胞超微结构有许多增生肥大的异常表现,PCNA的表达量明显增加（p<0.01）。（3） 7、20、60μg/kg的GCIP-27治疗8周后均能明显改善SHR胸主动脉的重构现象,其中60μg/kg的GCIP-27和6 mg/kg的氯沙坦的效果基本相同,MT/LD比值均比对照组减小了13.9%（p<0.01）,改善细胞超微结构的作用也基本一致。（4） 20、60μg/kg的GCIP-27治疗8周后能明显减少PCNA的表达量,其中60μg/kg的GCIP-27和6 mg/kg的氯沙坦效果相当,PCNA的表达量均减少了40%左右（p<0.01）。2. GCIP-27对SHR血管平滑肌细胞增殖肥大的影响（1） 3～100μg/L的GCIP-27能显著降低SHR血管平滑肌细胞的3H-TdR掺入率,cpm值分别比对照组减少了17.17%～40.99% （p<0.05或p<0.01）。（2） 3～100μg/L的GCIP-27能显著降低SHR血管平滑肌细胞的3H-Leu掺入率,cpm值分别比对照组减少了16.95%～39.78% （p<0.01）。3. GCIP-27对AngII诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响（1） 1μmol/L的AngII可使大鼠平滑肌细胞的细胞明显增殖,与正常对照组相比,AngII组与对照组相比MTT比色的吸光度A值增高了17.45%（p<0.01）,10μg/L～10 mg/L的GCIP-27组A值则显著降低,与AngII组相比,降低了10.05%～21.00%（p<0.05或p<0.01）（2） 1μmol/L的AngII可使大鼠平滑肌细胞的细胞数量显著增加,与正常对照组相比,细胞数量增加33.11%（p<0.05）。1 0μg/L～1 mg/L的GCIP-27则能显著减少AngII诱导的细胞数量增加,与AngII组相比,细胞数量减少27.72%～39.28%（p<0.05或p<0.01）。（3） 1μmol/L的AngII可使大鼠平滑肌细胞的蛋白含量显著增加,与正常对照组相比,蛋白含量增加35.25%（p<0.01）。10μg/L～1 mg/L的GCIP-27则能显著减少AngII诱导的蛋白含量增加,与AngII组相比,蛋白含量降低14.45%～39.66%（p<0.05或p<0.01）。4. GCIP-27抗血管重构的机制研究（1） 3～100μg/L的GCIP-27可显著降低SHR血管平滑肌细胞的[Ca2+]i水平,与对照组相比,Ca2+荧光强度下降了20.95%～58.39%（p<0.01）。（2） 3～100μg/L的GCIP-27均能明显减少p-ERK1/2的表达,与对照组相比,积分光密度降低了16.94%～29.44%（p<0.05或p<0.01）。结论:1. GCIP-27能明显改善SHR主动脉重构,并能降低SHR的血压,但其改善SHR主动脉重构的作用不完全依赖于降低血压的效应,表明GCIP-27在改善主动脉重构方面有较高的选择性。2. GCIP-27能抑制SHR血管平滑肌细胞的增殖和肥大,有效拮抗AngII对血管平滑肌细胞的促增殖作用。3. GCIP-27逆转血管重构的作用与降低血管平滑肌细胞[Ca2+]i,以及抑制血管平滑肌细胞中p-ERK1/2表达有关。
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