紫花苜蓿解旋酶基因的分离与耐逆性分析

论文摘要

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界上最重要的豆科牧草之一。然而,近年来随着草场生态环境的恶化,特别是干旱和盐碱化程度的加重,苜蓿的产量受到了严重的影响。培育耐逆性强的新品种,成为当前苜蓿生产过程中亟待解决的问题。研究苜蓿的耐逆机理将为进一步利用基因工程的手段培育耐逆新品种提供理论依据。解旋酶在植物耐受非生物胁迫过程中的作用是近几年才被发现的,研究表明过量表达某些解旋酶基因可以提高转基因植物的耐盐和耐低温的能力。本研究以紫花苜蓿为材料,利用RT-PCR方法从紫花苜蓿中分离得到受胁迫诱导表达的解旋酶基因,命名为MH1（Medicago sativa helicase）,并进一步对该基因的表达和它在多种逆境胁迫下的功能进行了分析。主要实验结果和结论如下:1.基因的分离和序列分析根据已知解旋酶基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR方法分离出一个编码406个氨基酸残基的cDNA,命名为MH1（Accession Number: EF011022）。氨基酸序列分析表明MH1蛋白含有DEAD-box解旋酶家族共有的九个保守区域,以及RNA解旋酶特有的Walker motif A序列（A-X-X-X-X-G-K-T）。进化树分析显示MH1蛋白与起始因子eIF4AⅢ亲缘关系比较近。2.MH1蛋白定位于细胞核中构建融合蛋白表达载体35S::MH1-GFP,在洋葱表皮细胞内瞬时表达,发现MH1蛋白定位于细胞核中。我们推测MH1参与了基因的表达调控。3.MH1基因在紫花苜蓿不同器官中表达并受非生物胁迫诱导半定量RT-PCR分析表明MH1基因在紫花苜蓿根、茎和叶中都有表达。进一步研究发现该基因的表达受NaCl、甘露醇、H2O2等胁迫处理诱导。4.表达MH1基因提高拟南芥的耐旱、耐盐和抗氧化胁迫能力构建植物表达载体pBI121-MH1转入拟南芥,用于研究MH1的功能。通过卡那霉素初步筛选得到36株抗性植株,基因组PCR和RT-PCR结果证实MH1基因确实整合进转基因拟南芥基因组中并且在转录水平得到了表达。纯合的转基因拟南芥种子在含有甘露醇、NaCl以及甲基紫精的GM培养基上萌发率高于转空载体的对照植株。在干旱、盐和氧化胁迫条件下转基因植株的生长情况明显好于对照植株。5.表达MH1基因提高了拟南芥的活性氧清除能力和渗透调节能力干旱和盐胁迫处理以后生理指标的测定结果表明,转基因植株能维持较高的超氧化物岐化酶SOD和抗坏血酸过氧化物酶APX活性。另外,转基因植株的渗透调节能力以及脯氨酸含量都高于对照植株。为进一步了解表达MH1基因提高植物耐逆性的分子机制,利用半定量RT-PCR技术分析不同转基因株系中MSD1、P5CS1和RD29A等基因的表达情况,结果显示这些基因的表达量均有提高。以上研究结果表明,MH1基因在植物耐受非生物胁迫的过程中起重要作用,它通过提高某些逆境响应基因的表达提高植物的活性氧清除能力和渗透调节能力使转基因植株的耐旱、耐盐和抗氧化胁迫能力得到提高。该研究为利用基因工程技术进行紫花苜蓿耐逆新品种的培育提供了新的资料。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 非生物胁迫与植物耐逆性相关基因
• 1.1.1 温度胁迫
• 1.1.2 水分胁迫
• 1.1.3 高盐胁迫
• 1.1.4 氧化胁迫
• 1.2 解旋酶
• 1.2.1 DEAD-box 解旋酶家族
• 1.2.2 DEAD-box 解旋酶家族成员的功能
• 1.2.3 DEAD-box 解旋酶与生物耐逆性
• 1.2.4 DEAD-box 解旋酶提高植物耐逆性的机理
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 PCR引物
• 2.1.4 酶及生化试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 取材
• 2.2.2 植物组织总RNA 的提取及检测
• 2.2.3 反转录cDNA 第一条链的合成
• 2.2.4 目的基因全长cDNA 的分离
• 2.2.5 MH1-GFP 融合蛋白表达载体转化洋葱表皮细胞
• 2.2.6 MH1 在紫花苜蓿中的表达分析（Northern 杂交）
• 2.2.7 紫花苜蓿中MH1 基因在胁迫处理后的表达分析（RT-PCR）
• 2.2.8 植物表达载体的构建
• 2.2.9 农杆菌介导的拟南芥转化
• 2.2.10 转基因植株耐逆实验
• 2.2.11 转基因植株生理指标的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 紫花苜蓿解旋酶基因的分离
• 3.2 MH1 基因的序列特征分析
• 3.2.1 MH1 基因的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列
• 3.2.2 MH1 基因的序列分析
• 3.3 MH1-GFP 融合蛋白的亚细胞定位
• 3.4 MH1 基因在紫花苜蓿中的表达分析
• 3.4.1 MH1 基因在紫花苜蓿不同器官中表达
• 3.4.2 MH1 基因的表达受多种逆境胁迫诱导
• 3.5 表达 MH1 基因提高转基因拟南芥的耐逆能力
• 3.5.1 MH1 基因转化拟南芥
• 3.5.2 转基因拟南芥的耐逆性分析
• 3.5.3 表达MH1 基因提高拟南芥耐逆能力的生理基础
• 3.5.4 MH1 基因的表达促进了某些逆境响应基因的表达
• 4 讨论
• 4.1 MH1是定位于细胞核中的DEAD-box RNA解旋酶
• 4.2 MH1基因在紫花苜蓿中的表达受多种逆境胁迫诱导
• 4.3 表达MH1基因提高拟南芥的耐旱、耐盐和抗氧化胁迫能力
• 4.4 表达MH1基因提高拟南芥耐逆性的生理与分子基础
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间整理和发表的论文情况
• 致谢