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矽肺纤维化生物活性介质调控网络研究

2020-11-29阅读(1019)

矽肺纤维化生物活性介质调控网络研究

论文摘要

矽肺是最为严重的一种职业病之一,是由于长期吸入大量含有游离二氧化硅粉尘所引起的一种不可逆转的渐进性加重的肺间质纤维化疾病。引起矽肺的主要职业有武警黄金水电部队的开矿挖掘作业,地方各行业如矿山开采、冶金工业中的原料破碎、陶瓷工业的原料加工,这些职业均可导致不同程度的肺纤维化。矽肺患病率逐年增多,造成直接和间接经济损失巨大,是危害最严重的职业病之一,而且已经成为重大社会公共卫生问题。国内外学者对矽肺纤维化的单个细胞因子作用虽已取得了一定的研究进展,但其系统网络调控机制尚未阐明。目的确定矽肺纤维化相关的生物活性介质,构建生物活性介质调控网络及其基因调控网络,以及二者整合网络,以此系统阐明矽肺纤维化的网络调控机制。方法本文主要应用系统生物学的方法构建生物活性介质调控网络。1.生物活性介质的确定。采用RevMan4.2进行meta分析,对研究的偏倚进行漏斗图、异质性、敏感性分析后进而确定相关活性介质。2.初始调控网络的构建。利用meta分析后数据,通过三次样条插值,采用微分方程模型并应用最小二乘法求解加权矩阵,构建活性介质调控网络。3.大鼠矽肺模型及实验后调控网络构建。应用气管暴露法注入二氧化硅粉尘悬液或生理盐水建立大鼠矽肺模型或对照模型。随机将Wistar大鼠分为矽尘组和对照组,每组再分为第1d,第3d,第7d,第14d,第21d,第28d共6个时间点,每个时间点分别取8只大鼠处死,收集相应血清和肺组织后系统检测相关生物活性介质。采用天狼猩红染色法结合偏振光显微镜观察肺组织胶原变化,并用图像分析系统定量分析Ⅰ、Ⅲ型胶原面积比;采用ELISA法系统测定血清中活性介质NF-κB、IL-1β、IL-10、TNF-α、INF-γ、TGF-β1、GM-CSF的含量;利用硝酸还原酶法测定NO含量。通过系统检测数据应用相关系数模型和微分方程模型进一步构建调控网络。4.干扰实验对调控网络的校正。同样应用气管暴露法建立大鼠矽肺模型,随机将32只大鼠分为TNF-α干扰组和矽尘组,每组再分为第7d和第14d两个时间点,每个时间点取8只大鼠并检测以上相同活性介质,通过比较两组之间各指标的差异校正调控网络。5.基因调控网络实验确证和扩充。造模后第14d用Trizol提取染矽尘组和对照组中肺组织总RNA,通过Illumina大鼠全基因表达芯片的检测,结合Diffscore差异分值筛选差异表达基因。通过KEGG、GO、DAVID等数据库平台,应用功能富集分析方法以及Cluster、TreeView等工具建立相关细胞因子基因聚类树,并利用差异表达基因相关系数矩阵构建基因调控网络,整合活性介质和基因调控网络,扩充和完善生物活性介质调控网络。结果1.meta分析后肺纤维化相关活性介质为TNF-α、TGF-β1、IFN-γ、MCP-1、IL-4、IL-6、IL-18、MMP-9、IL-10、IL-1β、IL-5、IL-8、IGF-1、GM-CSF、MMP-2、EGF。其中肺组织中TNF-α随时间的变化并不是直线升高,而是呈波浪性升高。肺组织、巨噬细胞、血清活性介质TNF-α各时点变化并不一致,其中巨噬细胞在第1天变化比其余两者更为明显,肺组织除第1天外各时点变化具有显著性差异,血清在各个时点变化均较肺组织表达弱一些。2.当权值阈值为2σ时,肺纤维化活性介质调控网络中重要节点为:IFN-γ、IL-10、IL-1β、IL-18、IL-6、IGF-1、GM-CSF、TGF-β1、TNF-α;非重要节点的活性介质为IL-4、IL-5、IL-8、MCP-1、MMP-2、MMP-9、EGF。当权值阈值为3σ时,肺纤维化活性介质调控网络中重要的节点变为:IFN-γ、IL-10、IL-1β、GM-CSF、TGF-β1、TNF-α;非重要节点的活性介质为IL-18、IL-6、IGF-1、IL-4、IL-5、IL-8、MCP-1、MMP-2、MMP-9、EGF。3.肺组织天狼猩红染色显微镜及图像分析仪观察表明第21天、第28天矽肺模型是成功的。实验组与对照组比较,血清中NF-κB和NO各时间点（除第21天NO外）表达具有统计学意义,动态表达比趋势较为一致。TGF-β1第21天、第28天表达增加,而IFN-γ第21天、第28天表达有降低趋势。TNF-α表达比呈先降低后增高趋势,但整体上与对照组相比没有统计学意义。IL-1β、IL-10、GM-CSF不同时间点动态表达比均大于1,前两者先升高后降低,后者呈波浪性升高。4.调控网络中度大于等于5的节点介质为IFN-γ、GM-CSF、TGF-β1、TNF-α;度小于5的节点为IL-10、IL-1β、NF-κB、NO、COLⅠ、COLⅢ。TNF-α可溶性受体干扰实验是可行的,该受体能够抑制矽尘诱导的大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的增加,抑制外周血清中NO、IL-1β、TGF-β1、NF-κB的蛋白表达。原调控网络中同TNF-α相关联的介质可能还包括COL I、GM-CSF等介质。5.矽肺纤维化血清中通过功能富集分类得出相关细胞因子基因共有29个,其调控网络中“度”大于5的关键基因为CCL7、GRN、IL-18、SFTPD、SPN、SPP1、TNF-α、TNFRSF。结论矽尘诱发机体活性介质的变化通过网络状态调控肺纤维化的形成。16种生物活性介质（TGF-β1,IFN-γ,MCP-1, IL-4, IL-6,IL-18,MMP-9, TNF-α,IL-10,IL-1β,IL-5,IL-8, IGF-1, GM-CSF, MMP-2, EGF）可能参与肺纤维化的调控,且具有一定的时空变化规律。时间趋势上活性介质的含量不是呈直线性,而是呈波浪性升高或降低趋势,各时点变化并不一致。空间表现上活性介质在细胞中出现最早,血清中出现最晚;各时点在肺组织中表达最强,血清中表达较弱。肺纤维化生物活性介质调控网络中重要节点介质为:IFN-γ、IL-10、IL-1β、GM-CSF、TGF-β1、TNF-α、NF-κB、NO;非重要节点为IL-18、IL-6、IGF-1、IL-4、IL-5、IL-8、MCP-1、MMP-2、MMP-9、EGF。在肺纤维化活性介质调控网络中,NO和NF-κB是一个启动中枢,而TNF-α、TGF-β1既担当启动子又担当致纤维化调控网络的中间传递子,GM-CSF、IL-1β、IFN-γ呈现级联瀑布放大或抑制网络效应。在网络效应活性介质促进和抑制功能不平衡的条件下形成肺纤维。

论文目录

  • 缩略词表
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪 论
  • 1.1 国内外研究现状
  • 1.1.1 矽肺纤维化基础的生物学研究
  • 1.1.2 数据整合和系统检测是构建调控网络的两个重要手段
  • 1.1.3 多因子联合研究以及相关疾病调控研究
  • 1.2 目前研究中存在的问题及研究假设
  • 1.3 研究目的
  • 1.3.1 矽肺纤维化生物活性介质的确定
  • 1.3.2 矽肺纤维化生物活性介质调控网络的构建
  • 1.3.3 矽肺纤维化生物活性介质及其基因调控网络的整合
  • 1.4 研究意义
  • 1.4.1 矽肺纤维化meta分析介质的确定意义
  • 1.4.2 矽肺纤维化调控网络的构建意义
  • 1.4.3 矽肺纤维化调控网络干扰实验的校正意义
  • 1.4.4 矽肺纤维化网络调控的系统整合意义
  • 1.5 研究内容
  • 1.5.1 矽肺纤维化生物活性介质的确定
  • 1.5.2 矽肺纤维化生物活性介质的变化规律
  • 1.5.3 矽肺纤维化活性介质调控网络构建
  • 1.5.4 矽肺纤维化生物活性介质及其基因调控网络的整合研究
  • 1.6 研究方法及工作流程
  • 1.7 预期研究成果
  • 1.7.1 矽肺纤维化活性介质的确定及其数据集的建立
  • 1.7.2 矽肺纤维化生物活性介质调控网络的构建
  • 1.7.3 矽肺纤维化生物活性介质及其基因整合网络的构建
  • 1.8 本文组织结构
  • 第二章 肺纤维化生物活性介质确定
  • 2.1 前言
  • 2.2 资料与方法
  • 2.2.1 研究目的及文献收集范围
  • 2.2.2 资料检索
  • 2.2.3 文献选择标准
  • 2.2.4 研究的纳入
  • 2.2.5 质量控制
  • 2.2.6 统计学分析
  • 2.2.7 meta分析结果森林图表示
  • 2.2.8 敏感性分析
  • 2.3 结果
  • 2.3.1 TNF-α检索结果
  • 2.3.2 造模后不同时点不同组分TNF-α的meta分析及偏倚判定
  • 2.3.3 不同时点肺组织TNF-α变化的meta分析
  • 2.3.4 肺纤维化TNF-α不同时空变化的meta分析
  • 2.4 讨论
  • 2.4.1 肺纤维化meta分析质量评价
  • 2.4.2 肺纤维化TNF-α时空变化meta分析过程评价
  • 2.4.3 肺纤维化TNF-α时空变化差异分析
  • 2.5 肺纤维化相关活性介质的确定
  • 2.5.1 研究对象
  • 2.5.2 文献检索
  • 2.5.3 质量控制
  • 2.5.4 meta分析方法
  • 2.5.5 meta分析结果
  • 2.6 小结
  • 第三章 肺纤维化生物活性介质调控网络的构建
  • 3.1 前言
  • 3.1.1 数据库分析平台研究
  • 3.1.2 分子调控网络的结构特性研究
  • 3.1.3 整体框架下认识复杂分子调控过程的研究
  • 3.1.4 研究方法
  • 3.1.5 生物分子调控网络的应用及存在的问题
  • 3.2 对象与方法
  • 3.2.1 研究对象
  • 3.2.2 肺纤维化相关活性介质数据预处理
  • 3.2.3 调控网络分析思想
  • 3.2.4 肺纤维化活性介质时间表达矩阵
  • 3.2.5 三次样条插值
  • 3.2.6 微分方程模型
  • 3.2.7 根据Wij建立加权矩阵绘制活性介质网络拓扑图
  • 3.2.8 调控网络的MATLAB软件实现
  • 3.3 结果
  • 3.3.1 肺纤维化相关活性介质的确定及编号
  • 3.3.2 肺纤维化不同时点相关活性介质数据标准化
  • 3.3.3 肺纤维化相关活性介质三次样条插值后拟合Y结果
  • 3.3.4 肺纤维化相关活性介质最小二乘法加权矩阵W结果
  • 3.3.5 肺纤维化相关活性介质网络模型的加权矩阵标化值
  • 3.3.6 肺纤维化相关活性介质网络的调控作用
  • 3.3.7 肺纤维化相关活性介质网络模型阈值提高后的加权矩阵标化值
  • 3.3.8 肺纤维化相关活性介质网络调控的修正
  • 3.4 讨论
  • 3.4.1 肺纤维化相关活性介质数据预处理的正确性
  • 3.4.2 肺纤维化生物活性介质之间的相互作用
  • 3.4.3 权值阈值的确定及阈值变化对调控网络的影响
  • 3.5 小结
  • 第四章 肺纤维化生物活性介质调控网络实验确证
  • 4.1 前言
  • 4.1.1 动物模型实验生物活性介质的选择
  • 4.1.2 生物活性介质检测时间点的选择
  • 4.1.3 生物活性介质调控网络的实验验证
  • 4.1.4 干扰活性介质及干扰时间点的选择
  • 4.1.5 通过动物干扰实验进一步修正调控网络
  • 4.2 材料与方法
  • 4.2.1 动物模型的建立
  • 4.2.2 生物样本的采集
  • 4.2.3 血清中活性介质的ELISA法测定
  • 4.2.4 血清中NO介质的测定
  • 4.2.5 普通石蜡切片的制作
  • 4.2.6 天狼猩红染色、图像采集与分析
  • 4.2.7 数据处理及统计学分析
  • 4.2.8 调控网络分析思想
  • 4.3 结果
  • 4.3.1 大体肺组织标本肉眼观
  • 4.3.2 Ⅰ、Ⅲ型胶原天狼猩红染色的偏振光显微镜观察结果
  • 4.3.3 矽肺动物模型各个时间点实验组和对照组活性介质比较
  • 4.3.4 矽肺纤维化不同时间点活性介质之间的相关矩阵
  • 4.3.5 矽肺动物模型纤维化活性介质调控网络
  • 4.3.6 TNF-α可溶性受体干扰后调控网络校正
  • 4.4 讨论
  • 4.4.1 矽肺纤维化模型及胶原动态变化比较
  • 4.4.2 矽肺纤维化模型血清中生物活性介质动态变化比较
  • 4.4.3 矽肺纤维化过程中活性介质的网络调控
  • 4.4.4 干扰实验的影响以及对调控网络的校正
  • 4.4.5 动物实验系统检测、调控网络构建的研究
  • 4.5 小结
  • 第五章 生物活性介质基因调控网络实验确证和扩充
  • 5.1 前言
  • 5.1.1 基因表达芯片研究的意义
  • 5.1.2 基因表达芯片制备及杂交
  • 5.1.3 数据的预处理和归一化
  • 5.1.4 基因表达矩阵
  • 5.1.5 差异表达基因的筛选
  • 5.1.6 基因调控网络
  • 5.2 材料与方法
  • 5.2.1 实验动物分组情况及样本量的确定
  • 5.2.2 气管暴露法建立大鼠矽肺模型
  • 5.2.3 生物样本的采集
  • 5.2.4 总RNA的提取
  • 5.2.5 基因表达谱芯片杂交及分析
  • 5.2.6 基因芯片的数据处理
  • 5.2.7 基因调控网络的构建
  • 5.3 结果
  • 5.3.1 差异表达基因的筛选
  • 5.3.2 矽肺中的基因功能聚类
  • 5.3.3 矽肺中的可能发生改变的生物学通路
  • 5.3.4 矽肺纤维化调控网络的构建
  • 5.3.5 矽肺纤维化细胞因子及其基因调控网络的整合
  • 5.4 讨论
  • 5.4.1 矽肺纤维化活性介质差异表达基因的筛选及聚类分析
  • 5.4.2 矽肺纤维化相关细胞因子基因调控网络的构建
  • 5.4.3 矽肺纤维化活性介质及基因调控网络整合分析
  • 5.4.4 对构建的调控网络完整性和准确性的评估
  • 5.5 小结
  • 第六章 总结、创新与展望
  • 6.1 总结
  • 6.2 创新
  • 6.3 展望
  • 参考文献
  • 附录1 检索策略
  • 附录2 肺纤维化部分活性介质结果分析及其漏斗图分析
  • 综述
  • 代表性论文
  • 攻读博士期间从事的科学研究工作与成果
  • 作者简历
  • 致谢

    • 相关论文文献

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