双功能β-葡聚糖酶—木聚糖酶与β-葡聚糖酶—植酸酶融合酶的优化构建及其酶学特性分析

论文摘要

β-葡聚糖酶（Glu）、木聚糖酶（Xyl）和植酸酶（Phy）是饲用复合酶制剂的常规组分,用于消除日粮中最重要的三种抗营养因子——β-葡聚糖、木聚糖和植酸（盐）,以提高饲料营养素的生物利用率。复合酶制剂一般是将分别生产的各种酶进行混配生产,通过基因工程技术生产双（或多）功能酶将大大降低复合酶制剂的生产成本。因此,本研究以上述三种酶的基因为出发点,分别进行了β-葡聚糖酶-木聚糖酶和β-葡聚糖酶-植酸酶两两间无连接肽的头尾相连融合,继而在对融合酶和亲本酶定性比较的基础上进行了连接肽的优化筛选。通过在拟融合的两个功能单位之间嵌入适当的多肽,获得了两个功能单位的催化特性均显著提高的β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶和成功表达双功能活性的β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶。主要研究内容和结果分述如下:β-葡聚糖酶-木聚糖酶和β-葡聚糖酶-植酸酶无连接肽融合酶构建应用基因重叠延伸技术（splicing-by-overlap extension,SOE）,分别构建了β-葡聚糖酶-木聚糖酶和β-葡聚糖酶-植酸酶无连接肽融合酶的基因gx和gp,并转化大肠杆菌BL21,均获得成功表达。融合酶gx表现出同时具有β-葡聚糖酶和木聚糖酶两种酶活的双功能。酶学特性分析表明,与亲本酶相比,融合酶gx的Glu部分的催化效率(Kcat/Km=6492)达到亲本酶(Kcat/Km=1563)的4.15倍,而Xyl部分的催化效率(Kcat/Km=903)却只有亲本(Kcat/Km=1311)的69%。除Glu部分的热稳定性不如亲本外,融合酶gx所有酶学特性（最适温度、最适pH及耐酸碱的稳定性）均类似于亲本。但是,融合酶gp检测不出β-葡聚糖酶和植酸酶任一亲本的活性。由此暗示,融合酶的功能单位间存在不一定不利的互作,通过适当连接肽的嵌入,使两单位间保持合适的距离,有可能获得两个功能单位效率均得到提高的β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶。对融合酶gp而言,两个功能单位的活性丧失,有可能与两两间的过分靠拢有关,所以嵌入适当连接肽也有可能获得同时具有β-葡聚糖酶和植酸酶活性的β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶。连接肽的优化与β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶基因的构建以柔性肽[GGGGS]n（n≤3）和具有α-螺旋的刚性肽[EAAAK]n（n≤3）以及另两条多肽为连接肽,构建α-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶基因,其中编码（GGGGS）3的五个碱基序列包括S3、S3-1、S3-2、S3-3和S3-4。应用SOE技术构建融合酶基因12个,获得了表现双功能活性的8个融合蛋白Glu-S3-Xyl、Glu-S2-Xyl、Glu-S1-Xyl、Glu-S-Xyl、Glu-H-Xyl、Glu-α3-Xyl、Glu-α2-Xyl和Glu-α1-Xyl,但连接肽S3-1、S3-2、S3-3和S3-4对应的融合酶基因未能在BL21中正常表达。上述结果显示,富含GC的（GGGGS）3碱基编码序列区域可能会因为形成稳定的二级结构而导致融合基因的翻译效率降低。此外,由mRNA翻译过程中核糖体A和P位上相邻两个氨酰-tRNA同工受体的兼容性引起密码子对的偏爱性,也可能直接影响mRNA的解码速度和准确性。因此,在连接肽的氨基酸残基序列组成确定的情况下,其碱基编码序列的设计也须给予足够重视。连接肽对双功能β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶的影响通过硫酸铵分级沉淀、缓冲液（pH 5.0）沉淀及阳离子交换等步骤,分别纯化了8个具有双功能的β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶,并对其进行了双功能酶学特性分析。与亲本相比,所有融合酶Glu部分的催化效率(Kcat/Km∶4748-6658)均优于亲本(Kcat/Km=1563),分别达到亲本的3.0-4.3倍;而融合酶Xyl部分的催化效率(Kcat/Km=1073-1875)达到亲本的82%-143%,均高于无连接肽的gx对应部分(Kcat/Km=903)。连接肽S2的融合效果最佳,融合酶Glu-S2-Xyl的Glu和Xyl部分的催化效率分别比亲本提高了326%和43%;其次是α3作为连接肽的融合酶Glu-α3-Xyl,其Glu和Xyl的催化效率分别高于亲本262%和31%。结果表明,通过嵌入适当的连接肽,使融合酶的两个功能单位形成有益的互作,可以达到双功能催化效率都优于亲本的效果。不同结构类型的柔性肽（如S2）和具有α-螺旋结构的刚性肽（如α3）都有可能实现双优的结果。结构类型相同的连接肽的长度也在一定程度上影响融合酶两个功能单位的催化效率。因此,连接肽的筛选对于融合蛋白的构建是完全必要的。β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶基因的优化构建以柔性肽（GGGGS）2、（GGGGS）3和α-螺旋刚性肽（EAAAK）1及（EAAAK）2为连接肽,构建4个β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶基因,并分别在BL21中成功表达4个β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶蛋白Glu-S2-Phy、Glu-pS3-Phy、Glu-α1-Phy及Glu-α2-Phy。其中,后三者表现出双功能活性,而Glu-S2-Phy仅具有β-葡聚糖酶活性。根据所用连接肽的氨基酸残基数,本研究中柔性和刚性两类连接肽在β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶中的折叠类型必然有所不同。结合连接肽S2对应融合酶Glu-S2-Xyl的双功能催化效率最佳的事实,证明连接肽的选择与需融合的两亲本酶结构及大小之间存在关联。综上所述,本研究的主要结果,一是通过连接肽的优化筛选而获得了三个Glu及Xyl部分催化效率均大幅或显著提高的双功能β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶,说明筛殉龅牧与氖谷诤厦傅牧礁龉δ艿ノ恍纬闪撕侠淼挠欣プ鳌６腔竦昧巳鼍哂兴δ艿摩?葡聚糖酶-植酸酶融合酶,并由此证明连接肽的选择与所需融合的两个功能蛋白的结构和大小相关。这些结果将为双（或多）功能饲料酶制剂的发展提供新的技术路线,也为多功能饲用酶的融合构建奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 三种饲用酶及双功能蛋白融合技术的研究现状
• 1.1 木聚糖酶的研究现状
• 1.1.1 木聚糖酶来源、结构与分类
• 1.1.2 木聚糖酶的作用机理
• 1.1.3 木聚糖酶的生化特性
• 1.1.4 木聚糖酶的应用
• 1.2 β-葡聚糖酶研究现状
• 1.2.1 β-葡聚糖酶来源、结构与分类
• 1.2.2 β-葡聚糖酶作用机理
• 1.2.3 β-葡聚糖酶的生化特性
• 1.2.4 β-葡聚糖酶的应用
• 1.3 植酸酶的研究现状
• 1.3.1 植酸酶来源、结构与分类
• 1.3.2 植酸酶反应机理
• 1.3.3 植酸酶生化特性
• 1.3.4 植酸酶应用
• 1.4 蛋白质融合技术研究进展
• 1.4.1 蛋白质间接融合技术
• 1.4.2 蛋白质直接融合技术
• 1.4.3 头尾相连融合和插入融合
• 1.4.4 连接肽蛋白融合的影响
• 1.5 选题依据与研究目标
• 2 β-葡聚糖酶-木聚糖酶与β-葡聚糖酶-植酸酶的无连接肽融合
• 2.1 材料
• 2.1.1 载体和菌株
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 试剂配置
• 2.2 方法
• 2.2.1 β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶基因的构建
• 2.2.2 β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶基因的构建
• 2.2.3 融合酶基因gx和gp重组表达载体的构建
• 2.2.4 融合蛋白双功能酶活鉴定
• 2.2.5 融合蛋白SDS-PAGE鉴定
• 2.2.6 融合蛋白gx及其亲本酶的纯化
• 2.2.7 酶特性分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 融合酶基因gx和gp的构建
• 2.3.2 融合基因重组表达载体的构建
• 2.3.3 融合蛋白的表达鉴定
• 2.3.4 融合蛋白gx及其亲本酶的纯化
• 2.4 讨论
• 3 β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶基因的连接肽优化及其表达
• 3.1 材料
• 3.1.1 载体和菌株
• 3.1.2 试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 融合基因的构建
• 3.2.2 融合基因表达载体的构建和表达
• 3.2.3 融合蛋白β-葡聚糖酶和木聚糖酶活鉴定
• 3.2.4 融合蛋白的SDS-PAGE鉴定
• 3.3 结果
• 3.3.1 融合基因的构建与测序
• 3.3.2 融合基因重组表达载体的构建
• 3.3.3 融合蛋白的表达鉴定
• 3.4 讨论
• 4 β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合蛋白的纯化及其酶特性分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 试剂与培养基
• 4.2 方法
• 4.2.1 双功能融合酶的纯化
• 4.2.2 酶谱分析
• 4.2.3 功能融合酶特性分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 双功能融合酶的纯化
• 4.3.2 酶谱分析
• 4.3.3 酶特性分析
• 4.4 讨论
• 5 β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶基因的优化构建及其表达
• 5.1 材料
• 5.1.1 载体和菌株
• 5.1.2 试剂
• 5.2 方法
• 5.2.1 β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶基因的构建
• 5.2.2 融合基因表达载体的构建和表达
• 5.2.3 融合蛋白β-葡聚糖酶和植酸酶酶活鉴定
• 5.2.4 融合蛋白的SDS-PAGE鉴定
• 5.3 结果
• 5.3.1 融合基因的构建与测序
• 5.3.2 融合基因重组表达载体的构建
• 5.3.3 融合蛋白的表达鉴定
• 5.4 讨论
• 6 结语
• 参考文献
• Summary
• 附件:攻读学位期间的主要成果