论文摘要
胞内存活能力是衡量细菌毒力的重要指标之一,有的病原性细菌被宿主吞噬细胞吞噬后可逃避吞噬细胞的杀伤作用,并在吞噬细胞内保持活性,甚至实现生长和繁殖,最终发挥毒力,引起宿主疾病的发生。本文以分离自患病鳗鲡的病原性嗜水气单胞菌为研究对象,首先建立了该菌体外感染鳗鲡吞噬细胞的数量模型;其次通过转座子诱变技术构建该菌的突变文库,并从突变库中筛选胞内存活缺陷的突变株,采用基因组步移技术获取转座子插入位点侧翼的突变基因;最后通过比较突变株与野生株在生长、运动和粘附等方面的生物学特性,试图探讨突变基因在嗜水气单胞菌胞内存活过程中的功能。研究结果如下:一、成功构建病原性嗜水气单胞菌体外感染鳗鲡吞噬细胞的数量模型。该模型中病原性嗜水气单胞菌对鳗鲡外周血吞噬细胞的最佳感染时间为30min,最佳感染复数（细菌数:吞噬细胞数）为100:1。此外,通过检测吞噬速率和杀菌速率评估建立起来的数量模型,结果发现鳗鲡外周血白细胞吞噬嗜水气单胞菌的速率较吞噬大肠杆菌的速率快,但杀灭该菌的速率却均显著低于杀灭大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的速率,从而证明建立的数量模型具有良好的可行性,为将来进一步研究嗜水气单胞菌在细胞内的存活机制奠定坚实的基础。二、采用了转座子（mini-Tn10）诱变技术构建嗜水气单胞菌突变文库,经过反复筛选从突变文库中得到109,159和160三株胞内存活能力明显降低的突变株。PCR鉴定三株突变均由转座子mini-Tn10插入引起的。三、基因步移（Genome Walking PCR）技术扩增转座子插入位点侧翼的未知序列,扩增后的产物测序,序列在GenBank中进行同源性比对。结果显示,突变株109的突变序列与GenBank中A.hydrophila subsp.hydrophila ATCC 7966的氢化酶4组件G（hydrogenase-4component G）基因同源性最高,达到97%;突变株159中的突变序列与A.hydrophila subsp.hydrophila ATCC 7966的乙酰乳酸合成酶的一个关于操纵子前导肽的大亚基（acetolactate synthase,large subunit,biosynthetic type ilvBEDA operon leader peptide）同源性最高,达到95%;突变株160中的突变序列与A.hydrophila subsp.hydrophila ATCC 7966的AsmA家族蛋白（AsmA family）基因同源性最高,达到95%。四、比较嗜水气单胞菌野生型菌株和胞内存活突变株在生长,运动和粘附方面的生物学特性,结果发现与野生株相比,109和159的生长能力明显下降;运动能力方面160突变株较野生株有较明显下降;粘附能力方面,与野生株相比,突变株的粘附能力均有明显降低。综上所述,氢化酶、乙酰乳酸合成酶及AsmA家族蛋白可能通过影响菌株生长、运动、粘附等特性进而影响嗜水气单胞菌的胞内存活能力。研究结果为进一步了解嗜水气单胞菌的致病机理奠定了基础,为嗜水气单胞菌病的防治提供了理论依据。