秸秆纤维素的酶解及Bacillus. sp. bs-1的内切葡聚糖酶基因克隆和表达研究

论文摘要

纤维素类物质是自然界中存在的最廉价、最丰富的一类可再生资源。对解决当今世界所面临的环境污染、粮食短缺、饲料资源紧张和能源危机等问题具有重大现实意义。纤维素酶是指能水解纤维素β-1,4-葡萄糖苷键,使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称,它不是单一酶,而是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶的作用机制至今尚不完全清楚。能够产生纤维素酶的微生物的产酶能力低下,且所产生的酶的组分不全或不平衡。目前大部分纤维素酶基因的表达水平较低。纤维素酶基因工程的主要难题是如何实现不同组分的有效表达和如何提高表达量。本文首先对甜高粱秸杆进行了各种预处理,包括机械处理、高温处理、无机溶剂处理、有机溶剂处理和超声波处理。之后用纤维素酶进行降解,用DNS法来确定产生还原糖的浓度,分析和比较各种预处理效果,从而得出以下结论,即在干燥高温条件下处理效果最好,超声波的处理效果也相对较高,稀酸碱的处理效果相对较弱。从内蒙古乌拉特前旗乌梁素海附近一造纸厂附近取的泥样,用选择性培养基CMC-Na培养基和鉴定活力的刚果红培养基,筛选纯化出一株高酶活的纤维素降解菌。然后对该细菌用16S rDNA的方法进行分子鉴定,结果与NCBI数据库进行BLAST,其16S基因与枯草芽孢杆菌同源性达到98%,并通过显微镜的形态观察可断定为该菌属于芽孢杆菌属,将其命名为bs-1。以芽孢杆菌bs-1的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到含有内切葡聚糖酶基因的DNA片段,将其连接到pMD19-T载体中,序列分析表明,克隆得到的DNA片段全长1503 bp,编码一个含有500个氨基酸的多肽。与其他芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因序列比对,其核苷酸同源率为93% 96%,其编码的氨基酸序列的同源性在95%98%。将含内切葡聚糖酶基因的重组质粒pMD19-T-C进行提取,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,与相同酶切的表达载体pET-30a（+）相连接,构建了重组表达载体pEt-30a-C,并转化到表达宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）中,用IPTG进行了诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果表明在大约55KD的位置上有表达的蛋白质条带。经DNS法测定表达的内切葡聚糖酶的活力为270 U/mL,为出发菌（175.54U/mL）的1.5倍。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 纤维素简介
• 1.1.1 纤维素的分子结构
• 1.1.2 植物秸秆纤维素的预处理
• 1.2 纤维素酶的研究进展
• 1.2.1 纤维素酶的组成及分类
• 1.2.2 纤维素酶的结构及作用机理
• 1.2.3 产纤维素酶的主要微生物群类
• 1.2.4 产纤维素酶菌株的筛选
• 1.2.5 纤维素酶在分子生物学中的研究进展
• 1.3 纤维素预处理及纤维素酶研究的目的和意义
• 1.3.1 纤维素预处理的目的和意义
• 1.3.2 纤维素酶研究的目的和意义
• 1.3.2.1 纤维素酶对动物营养的影响
• 1.3.2.2 纤维素酶对造纸工业的影响
• 1.3.2.3 纤维素酶对洗涤工业的影响
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 样品采集与处理
• 2.1.2 主要试剂与试剂盒
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 培养基配方
• 2.1.6 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 甜高粱秸秆的预处理
• 2.2.1.1 机械处理
• 2.2.1.2 高温处理
• 2.2.1.3 超声波处理
• 2.2.1.4 酸碱处理
• 2.2.1.5 有机溶剂处理
• 2.2.2 纤维素酶活的测定（DNS 法）
• 2.2.2.1 葡萄糖标准曲线的制作
• 2.2.2.2 纤维素酶的活性测定采用DNS 法
• 2.2.3 高效降解纤维素的细菌的筛选
• 2.2.4 菌株的165 rDNA 分子鉴定
• 2.2.4.1 细菌总DNA 的提取
• 2.2.4.2 扩增165 rDNA 的PCR 反应
• 2.2.4.3 凝胶回收PCR 产物
• 2.2.4.4 目的片段的连接
• 2.2.4.5 感受态E.Coli 细胞的制备
• 2.2.4.6 目的片段的转化
• 2.2.4.7 阳性克隆的筛选和鉴定
• 2.2.5 Bacillus. sp. bs-1 内切葡聚糖酶基因的克隆
• 2.2.5.1 扩增内切葡聚糖酶基因的PCR 反应
• 2.2.5.2 PCR 产物的凝胶回收
• 2.2.5.3 目的片段的连接
• 2.2.5.4 目的片段的转化
• 2.2.5.5 阳性克隆的筛选和鉴定
• 2.2.6 葡聚糖内切酶在大肠杆菌BL21（DE3）内的表达
• 2.2.6.1 重组质粒的构建
• 2.2.6.2 重组质粒的转化
• 2.2.6.3 重组质粒的提取
• 2.2.6.4 双酶切检测连接状况
• 2.2.6.5 重组质粒（表达载体pET-30a-C）的转化
• 2.2.6.6 IPTG 的诱导表达
• 2.2.6.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3 结果与分析
• 3.1 甜高粱秸杆的预处理分析
• 3.1.1 葡萄糖标准曲线的确定
• 3.1.2 机械粉碎处理对酶降解的影响
• 3.1.3 高温处理对酶降解的影响
• 3.1.4 超声波处理对甜高粱秸秆酶解影响
• 3.1.5 酸处理对甜高粱秸秆酶解影响
• 3.1.6 碱处理对甜高粱秸秆酶解影响
• 3.1.7 有机溶剂处理对甜高粱秸秆酶解影响
• 3.2 细菌的筛选
• 3.3 细菌的鉴定
• 3.3.1 革兰氏染色鉴定
• 3.3.2 16S rDNA 分子鉴定
• 3.3.3 16S rDNA 序列的测定及分析
• 3.4 内切葡聚糖酶的分子克隆
• 3.4.1 内切葡聚糖酶基因的扩增
• 3.4.2 带有内切葡聚糖酶基因的重组表达载体pET-30a（+）-C 的构建
• 3.5 内切葡聚糖酶基因的表达
• 3.5.1 内切葡聚糖酶氨基酸序列分析
• 3.5.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 4 结论与讨论
• 4.1 秸秆纤维素预处理
• 4.2 降解纤维素菌株的筛选
• 4.3 Bacillus.sp.bs-1 内切葡聚糖酶的克隆
• 4.4 内切葡聚糖酶在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介