壳聚糖硬脂酸嫁接物胶团的靶向修饰研究

论文摘要

聚合物胶团是一类胶体型药物载体,一般呈球形,纳米尺度大小（10～100nm）,具有独特的核-壳结构,其疏水性内核提供药物储库作用,亲水性外壳有利于胶团在水性环境的稳定性。聚合物胶团可以通过主动或被动的方式,实现药物的靶向给药:可通过“渗透与保留作用”（permeability and retention effect,EPR）被动靶向肿瘤部位;胶团表面可嫁接配体（如叶酸等）,实现药物的主动靶向。最新研究表明,聚合物胶团还可作为选择性的细胞器靶向药物载体,靶向特定的细胞器,如线粒体、高尔基体等。这种细胞器靶向的载体功能,在基因给药系统中具有广泛的应用前景。壳聚糖（chitosan,CSO）是一类由氨基葡萄糖组成的阳离子聚合物,具有很好的生物相容性、低毒性和可生物降解性。研究发现,壳聚糖及其衍生物对生物大分子药物具有保护作用,以该类聚合物为载体制备的多肽、蛋白质、核酸类药物的口服制剂已成为该类药物的研究热点,近年来已广泛应用于携带质粒DNA的基因治疗研究。低分子量壳聚糖不存在难以被消化道吸收而在人体内蓄积的问题,因此,研究低分子量壳聚糖作为药物载体材料具有非常重要的意义。本课题以1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropl）carbodiimide,EDC）为交联偶合剂,通过壳聚糖的氨基和硬脂酸（stearic acid,SA）的羧基结合,将SA嫁接到CSO主链上形成壳寡糖-硬脂酸嫁接物（stearic acid gafted chitosan,CSO-SA）,作为药物载体材料。为减少巨噬细胞的对聚合物胶团的摄取,进一步将PEG嫁接到CSO主链上,以期延长胶团在血液中的半衰期。为实现载体的主动靶向性,将半乳糖配体引入嫁接物分子,以增加胶团在富含半乳糖受体的肝癌细胞中的摄取,实现肝靶向作用。为延缓药物从胶团中的释放过程,以使更多的药物能在治疗部位蓄积,参照阳离子载体利用正负电荷的相互作用而包载并浓缩带负电的基因的原理,采用三磷酸腺苷对CSO-SA胶团进行物理修饰,利用正负电荷复合作用使胶团的结构更为紧密,延缓药物的释放,以期提高药物在靶部位的蓄积。在PEG修饰胶团的研究中,为寻求PEG修饰的最优化条件,设定不同的修饰比例并加以筛选。采用H1-NMR对CSO-SA和PEG修饰的CSO-SA（PEG-CS-SA）进行了结构确证。芘荧光法测定临界胶团浓度（critical micelleconcentration,CMC）,微粒粒度及表面电位分析仪测定胶团的粒径和表面电位,原子力显微镜观察胶团的形态,以考察PEG修饰前后载体材料的理化性质。以芘为荧光探针,1-十二烷基氯化吡啶（1-Dodecylpyridinium chloride,DPC）为荧光淬灭剂,测定PEG修饰前后胶团的疏水核个数,考察PEG修饰后胶团多个疏水核的特殊结构变化。采用细胞定量摄取实验,考察胶团的PEG修饰对减少巨噬细胞（小鼠巨噬细胞RAW264.7）摄取的影响。为考察亲水性PEG在减少巨噬细胞对载体的摄取的同时,是否会减少肿瘤细胞和正常细胞对胶团的摄取,本研究进一步定量考察了CSO-SA和PEG-CSO-SA胶团在人肝癌细胞HepG2、永生化小鼠正常肝细胞株BRL-3A的摄取情况。以丝裂霉素（Mitomycin C,MMC）为模型药物,制备嫁接物载药胶团;在评价载药胶团的理化性质的基础上,探讨嫁接物胶团PEG修饰前后对抗肿瘤药物疗效的影响。本研究采用重均分子量为28 Kda的低分子量壳聚糖合成CSO-SA和PEG-CSO-SA。PEG-CSO-SA的核磁共振（H1-NMR）图谱中,δ=3.4～3.6 ppm的峰归属于PEG,表明PEG嫁接到CSO-SA上。采用三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS）法测定CSO-SA和PEG-CSO-SA的氨基取代度（DS）。TNBS可以和游离氨基反应,其产物在344 nm处有吸收。经测定,CSO-SA的氨基取代度为8.8±0.2%,而不同修饰比例的PEG-CSO-SA的氨基取代度为11.8%～19.8%,略高于CSO-SA,并且随着PEG的用量增加而增加,表明PEG已嫁接到CSO-SA上。CSO-SA和PEG-CSO-SA在水性介质中具有自聚集的能力,芘荧光法测得CSO-SA在PBS（pH7.4）中的临界胶团浓度（CMC）为13.8μg/mL,而不同修饰比例的PEG-CSO-SA的CMC为11.5～12.5μg/mL,表明引入PEG亲水性链后嫁接物形成胶团的能力并没有下降。硬脂酸（SA）只是部分取代了壳聚糖（CSO）上的游离氨基,尚有80%左右的氨基未被取代,因此CSO-SA及其PEG修饰胶团表面仍然荷正电,表面电位分析仪测得胶团在PBS（pH7.4）中表面电位在15mV左右。以1-十二烷基氯化吡啶（1-Dodecylpyridinium chloride,DPC）为荧光淬灭剂,采用稳定荧光淬灭方法,测得CSO-SA胶团中,每个疏水核区域中硬脂酸的个数nSA为4.5±0.3个,平均每个聚合物分子链上有3.2±0.2个疏水核区域;而不同修饰比例的PEG-CSO-SA胶团中,每个疏水核区域中硬脂酸的个数nSA为5.4～7.8个,平均每个聚合物分子链上有2.7～1.8个疏水核区域,表明PEG修饰后,由于亲水性的增加,每个疏水核区域需要的硬脂酸基团数量增加,胶团的结构有所改变,但仍保留多个疏水核的特殊结构。采用荧光分光光度计,定量研究经异硫氰基荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）标记的CSO-SA和PEG-CSO-SA胶团被HepG2、BRL-3A和RAW264.7细胞摄取的情况。CSO-SA胶团在HepG2和BRL-3A细胞中的摄取较少,孵育24 h后只摄取了15%左右;而在RAW264.7细胞中的摄取较多,孵育24 h后摄取58.4±0.6%。亲水性PEG链的引入可以显著减少巨噬细胞对胶团的摄取量,并且随着PEG修饰比例的增加,巨噬细胞的摄取量大幅度减少。当PEG的修饰比例达到5:1时,RAW264.7对胶团的摄取量减少到了17.7±0.9%（24h）。然而,PEG-CSO-SA在HepG2和BRL-3A中的摄取几乎没有受到PEG修饰的影响。以MTT试验法测得的细胞活力结果显示,CSO-SA胶团在HepG2细胞中的IC50值为392.4±7.2μg/mL,不同修饰比例的PEG-CSO-SA胶团的IC50值为380～390μg/mL,细胞毒性较低,是一种安全的载体材料。以HepG2为模型细胞,丝裂霉素（Mitomycin C,MMC）为模型药物,考察CSO-SA和PEG-CSO-SA载药胶团的抗肿瘤活性。CSO-SA载药胶团（CSO-SA/MMC）和PEG-CSO-SA载药胶团（PEG-CSO-SA/MMC）的药物包封率均在35%左右。游离MMC在HepG2细胞的IC50值为1.97±0.2μg/mL,CSO-SA/MMC的IC50值为0.13±0.02μg/mL,药效提高了14倍。而不同PEG修饰比例的PEG-CSO-SA/MMC的IC50值为0.11～0.14μg/mL,与CSO-SA/MMC的IC50值没有显著性差异,说明PEG修饰后不影响嫁接物胶团对药物的细胞内转运,可保持胶团给药系统的细胞水平的疗效。哺乳动物肝细胞膜上的无唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor,ASGP-R）是一种肝结合蛋白（hepatic binding protein,HBP）,能专一性识别分子末端带有半乳糖残基的糖蛋白并与之结合,定向转运到肝细胞内的溶酶体进行代谢。本研究进一步利用嫁接物分子中壳聚糖上残留的氨基,进行半乳糖的化学修饰,并评价半乳糖修饰嫁接物胶团的理化性质。采用荧光倒置显微镜研究未修饰胶团及半乳糖修饰胶团在HepG2及A549细胞的摄取情况。研究结果显示,半乳糖修饰后,嫁接物胶团在HepG2细胞中的摄取明显增加,而在A549细胞中的摄取与未修饰胶团没有差异。在利用三磷酸腺苷（ATP）对CSO-SA胶团进行物理修饰的研究中,考察了ATP的用量对载药胶团粒径、表面电位以及药物体外释放的影响。随着ATP用量的增加,载药胶团的粒径减小,表面电位降低。当ATP与CSO-SA的质量比为0.2:1时,对药物的控释没有显著效果;当ATP与CSO-SA的质量比为0.4:1时,控释效果明显。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 壳聚糖硬脂酸嫁接物的制备及理化性质研究
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 低分子量壳聚糖的制备
• 2.2 壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成及结构确证
• 2.3 嫁接物理化性质测定
• 3 结果与讨论
• 3.1 嫁接物的合成与结构确证
• 3.2 嫁接物的氨基取代度
• 3.3 临界胶团浓度测定
• 3.4 嫁接物胶团的粒径与表面电位
• 3.5 原子力显微镜观察
• 4 小结
• 第二章 嫁接物胶团的PEG修饰
• 1 材料和仪器
• 2 实验方法
• 2.1 PEG修饰嫁接物的合成
• 2.2 核磁共振氢谱确证 PEG-CSO-SA结构
• 2.3 PEG-CSO-SA的理化性质评价
• 2.4 CSO-SA和 PEG-CSO-SA胶团的细胞摄取研究
• 2.5 载药胶团的抗肿瘤药效研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 PEG修饰嫁接物的合成与结构确证
• 3.2 PEG修饰前后胶团的氨基取代度
• 3.3 临界胶团浓度测定
• 3.4 嫁接物胶团 PEG修饰前后的粒径电位
• 3.5 原子力显微镜观察
• 3.6 PEG修饰前后单个嫁接物分子上的疏水核个数
• 3.7 PEG修饰前后胶团在不同细胞中的摄取比较
• 3.8 PEG修饰前后载药胶团的细胞药效学研究
• 4 小结
• 第三章 嫁接物胶团的半乳糖修饰研究
• 1 材料和仪器
• 2 实验方法
• 2.1 半乳糖修饰嫁接物的合成
• 2.2 半乳糖修饰嫁接物的结构确证
• 2.3 半乳糖修饰嫁接物胶团的粒径与表面电位
• 2.4 半乳糖修饰嫁接物胶团的细胞摄取
• 3 结果与讨论
• 3.1 半乳糖修饰嫁接物的合成与结构确证
• 3.2 半乳糖修饰嫁接物胶团的粒径与表面电位
• 3.3 细胞摄取实验
• 4 小结
• 第四章 嫁接物胶团的三磷酸腺苷修饰研究
• 1 材料和仪器
• 2 实验方法
• 2.1 羟基喜树碱载药胶团制备
• 2.2 空白胶团与载药胶团的粒径与表面电位
• 2.3 包封率和载药量的测定
• 2.4 三磷酸腺苷修饰载药胶团
• 2.5 三磷酸腺苷修饰胶团的粒径与表面电位
• 2.6 体外释放实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 胶团的粒径与表面电位
• 3.2 包封率和载药量
• 3.3 体外释放实验
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢