论文题目: 草鱼MyoD基因cDNA克隆和表达研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 动物遗传育种与繁殖
作者: 王立新
导师: 陈宏,罗建仁
关键词: 草鱼,基因,序列,表达,活性检测
文献来源: 西北农林科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: MyoD基因是生肌调节因子MRFs家族的主要成员之一,是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主导调控基因之一,对骨骼肌的形成和分化起主要作用,MyoD缺失可导致成肌细胞的增殖和分化无法进行。而MSTN(myostatin,肌肉生长抑制素)基因属于TGF-β(transforming growth factor beta,转化生长因子)超家族,其功能是抑制成肌细胞的过度增殖,是肌肉发育的负调控基因。现代肌肉发育生物学的研究表明,影响脊椎动物肌肉生长和肌肉品质的肌纤维的数量在出生前就已决定,出生后肌肉的生长主要靠肌纤维长度和周径的增大,而肌纤维的增粗又会影响肌肉的嫩度和肉用品质。同时获得高的肌肉生长(净肉率)和优良的肉质品质是肉用动物生产一直追求但却无法实现的理想目标。MyoD及其相关基因的发现为解决这一难题提供了可能,但对于该基因的研究目前还主要集中在基因的结构功能、组织表达、多态性以及肌肉瘤的医学诊断上,而在肉用动物生产中的研究还未受到重视。本研究以我国池塘主要养殖品种草鱼为研究对象,旨在通过对草鱼MyoD基因克隆、重组表达以及在不同发育阶段表达规律的研究,为鱼类肌肉品质改良提供理论依据,也为鱼类高效养殖探索新的途径,该项研究对于我国这样一个水产养殖大国来说无疑具有很高的社会和经济价值。 为此本研究用RT—PCR和RACE技术从受精后22h(水温约为24℃)的草鱼肌节期胚胎总RNA中扩增获得了草鱼MyoD全长cDNA序列,并对核苷酸和氨基酸序列进行了分析,构建了草鱼MyoD基因的原核和真核表达载体,获得了相应的重组基因工程菌,并对基因工程菌进行了诱导表达研究;与此同时,本研究还对MyoD基因在草鱼不同发育阶段的表达规律及其与负调控基因MSTN之间的表达关系进行了初步研究,得到如下结果: 1.首次克隆并获得了草鱼MyoD全长cDNA序列。 草鱼MyoD cDNA序列全长为1597bp,其中编码蛋白的开放阅读框位于186～1011bp,长825bp,共编码275个氨基酸;编码的蛋白的分子量为30.87kD。蛋白质结构分析表明草鱼MyoD基因具有该家族基因典型的碱性螺旋环螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)结构域,其中编码肽链的第1-84个氨基酸为草鱼MyoD基因的Basic区,第98～142个氨基酸为草鱼MyoD基因的HLH结构域;SignalP 3.0和Tmpred(prediction oftransmembrane regions and orientation)在线结构分析也发现,该肽链没有信号肽和跨膜区段,这和该基因只在胚胎期骨骼肌细胞中表达的组织特异性相符。 2.分析并揭示了MyoD基因结构和脊椎动物进化的关系 通过对不同分类地位脊椎动物MyoD基因的核苷酸序列和氨基酸序列深入分析发现:①MyoD基因的保守性较高,且氨基酸肽链的长度随动物由低等到高等有逐渐加长
论文目录:
摘要
Abstact
第一章 脊椎动物肌肉的发育和调控
1 肌肉发生、发育的组织学研究
1.1 肌肉的起源和发生
1.2 肌肉组织的分类
1.3 骼肌的结构
1.4 骨骼肌的进化
2 肌肉发育的细胞学研究
2.1 肌源干细胞
2.2 肌卫星细胞
3 肌肉发育的基因调控
3.1 MyoD基因家族
3.2 IGFs
3.3 MSTN
3.4 锌指蛋白及其对肌肉发育的调节
3.5 其他因子对肌肉发育的影响
4 本研究的目的、意义和展望
4.1 研究的目的和意义
4.2 研究展望
第二章 草鱼MyoD基因全长cDNA克隆
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验用草鱼受精卵
1.1.2 菌种和质粒
1.1.3 相关试剂及试剂盒
1.1.4 培养基
1.1.4.1 LB液体培养基配制
1.4.4.2 Amp~+ LB固体培养基
1.2 实验方法
1.2.1 引物的设计和合成
1.2.2 草鱼胚胎总RNA的提取
2 结果
2.1 草鱼MyoD基因cDNA 3’末端扩增
2.2 草鱼MyoD基因cDNA 5’末端扩增
2.3 草鱼MyoD基因全长cDNA序列
2.4 草鱼MyoD基因和蛋白质结构分析
2.5 草鱼MyoD基因氨基酸序列的信号肽分析
2.6 不同动物MyoD基因序列的同源性比较
第三章 草鱼MyoD基因在大肠杆菌中的表达研究
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株与质粒
1.1.2 主要药品和试剂
1.1.3 培养基
1.1.4 常用溶液及缓冲液
1.2 实验方法
2 结果
2.1 草鱼MyoD成熟肽改造PCR扩增
2.2 草鱼MyoD原核表达质粒PBV220—MyoD的构建及检测
2.3 重组菌的诱导表达
第四章 草鱼MyoD基因在毕赤酵母菌中的表达研究
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 草鱼MyoD基因真核表达载体构建
2.2 重组毕赤酵母工程菌的转化和检测
2.3 重组毕赤酵母工程菌的诱导表达
第五章 草鱼MyoD、MSTN基因在草鱼不同发育阶段表达规律的研究
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 实验方法
2 结果
2.1 草鱼MyoD和β-actin基因在不同发育阶段的表达
2.2 草鱼MSTN基因在不同发育阶段的表达
第六章 讨论和结论
1 讨论
1.1 草鱼MyoD基因及其结构
1.2 不同动物MyoD及其氨基酸序列同源性比较及其与肌肉发育的关系
1.3 草鱼MyoD基因原核表达
1.4 草鱼MyoD基因在毕赤酵母中的表达
1.5 草鱼MyoD基因在不同发育阶段的表达规律
1.6 草鱼MSTN基因在不同发育阶段的表达规律及其和MyoD基因的互作
2 结论
2.1 首次克隆并获得了草鱼MyoD全长cDNA序列。
2.2 分析并揭示了MyoD基因结构和脊椎动物进化的关系
2.3 构建了草鱼MyoD基因的原核表达载体并获得了重组蛋白
2.4 首次构建了草鱼MyoD基因毕赤酵母真核表达载体pPICZαA-MyoD，并获得了基因工程菌和重组蛋白
2.5 首次在草鱼上对控制肌肉发育的正调控基因MyoD和负调控基因MSTN的表达关系进行了初步探索
参考文献
附录
致谢
作者简介
发布时间: 2007-04-06
参考文献
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