抗肺癌单链抗体融合人胸腺素α1的构建及表达

论文摘要

胸腺素al（Thymosin alpha l,Tal）是由28个氨基酸组成的酸性多肽,作为免疫增强剂,其除具有免疫刺激效应外,还具有抗病毒及抗肿瘤功能。目前,其广泛应用于非小细胞性肺癌、病毒性肝炎及免疫缺陷等重大疾病的临床治疗。其分子量很小,只有3108D,故利用基因工程获取Tal单体显得很困难。迄今,已有若干研究报道将Tal基因与具有特定生物学功能的效应分子进行融合表达,如与谷胱甘肽、硫氧还蛋白及干扰素α-2b等的融合,均取得较高效的表达结果。抗肺癌单链抗体（LC-1 single-chain Fv,LC-1 ScFv）是对抗肺癌杂交瘤细胞株（LC-1）分泌的单克隆抗体进行基因改造而获得的,是具有与抗原结合能力的最小抗体片段。在抗体分子上连接细胞毒素、细胞因子或破坏细胞结构的酶、药物及放射性同性素,可构建对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用的复合物,后者统称为免疫毒素或生物导弹。免疫毒素在早期肿瘤的诊断、治疗中具有重要作用,同时也是手术、化疗后晚期癌症的有效治疗手段之一。有人将肿瘤坏死因子、绿脓杆菌外毒素、白喉毒素与ScFv连接,用于肿瘤的导向治疗。本实验首次将完整的抗肺癌单链抗体重组基因与Tal基因偶联,进行融合表达。获得表达的双功能蛋白具有抗体的靶向性及Tal的活性,既克服了Tal表达困难的缺点,又能借助ScFv直达病灶的特性获得良好的治疗效果,为肺癌的治疗及检测探索了新途径。本实验从高分泌量和活力较高的抗肺癌杂交瘤单克隆细胞株抽提总RNA,并反转录成cDNA。设计引物,利用PCR获得单链抗体的重链和轻链基因,克隆到pUCm-T载体并测序。利用重叠延伸PCR法将重链和轻链基因构建为单链抗体形式。修饰后的单链抗体与pET-22b（+）质粒连接,构建质粒pET22-ScFv。同时,以重组质粒pET39-Tal为模板,PCR获得Tal基因,连接到pUCm-T载体上。对质粒pET22-ScFv、pLJCm-T-Tal双酶切,回收相应片段,将Tal连接到ScFv的C端,构建ScFv-Tal重组体,并转化大肠杆菌BL2l,进行融合表达。在最佳表达条件（30℃,IPTG浓度0.5mmol/L,诱导表达5h）下,外源基因产物表达量占全菌蛋白的30%左右。

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摘要

Abstract

论文综述部分

第一章胸腺素α1的研究进展

前言

1.Tα1的分布

2.Tα1作用机制

2.1 Tα1对胸腺细胞凋亡的调节作用

2.2 Tα1作为BRM的作用机制

2.3 Tα1对神经系统的调节

3.Tα1的临床应用

3.1 肺癌

3.2 病毒性肝炎

3.3 肿瘤

3.4 其他

4.Tα1的基因工程

参考文献

第二章单链抗体的研究进展

1.ScFv的结构及其特点

2.ScFv的设计和构建

3.ScFv的表达

3.1 启动子、信号肽、ScFv中的接头

3.2 成熟ScFv的一级结构

3.3 宿主菌及ScFv诱导表达的条件

3.4 共表达分子伴侣

4.ScFv的应用

4.1 导向载体

4.2 对病毒、毒素等的中和作用

4.3 基因治疗

4.4 抗肿瘤疫苗

5.ScFv的不足与展望

参考文献

论文实验部分

第三章抗肺癌单链抗体融合人胸腺素α1的构建及表达

前言

1.实验材料和仪器

1.1 菌种及质粒

1.2 酶

1.3 各种试剂盒

1.4 缓冲液及其他溶液

1.5 培养液和固体培养基

1.6 其它主要试剂和商品来源

1.7 电泳胶

1.8 PCR引物

1.9 主要仪器

2.方法

2.1 PCR扩增

2.2 片段纯化

2.3 连接

2.4 感受态细胞的制备

2.5 转化细胞

2.6 蓝白斑筛选

2.7 PCR筛选

2.8 质粒抽提

2.9 酶切鉴定

2.10 重叠延伸PCR法构建单链抗体

2.11 pUCm-T-ScFv'的构建

2.12 单链抗体基因的改造

2.13 pET22-ScFv的构建

2.14 pUCm-T-Tα1质粒的构建

2.15 pET-22-ScFv-Tα1质粒的构建及鉴定

2.16 Tα1-ScFv的诱导表达

3.结果

3.1 抗体重链和轻链可变区的克隆

3.2 重链和轻链的序列测定

3.3 轻链基因的修饰

3.4 单链抗体的构建

3.5 单链抗体基因的改造

3.6 pET22-ScFv的构建

3.7 pUCm-T-Tα1基因的构建

3.8 Tα1-ScFv基因构建

3.9 pET-22-ScFv-Tα1在大肠杆菌中BL21中的表达

4.讨论

参考文献

附录1 pET-22b（+）质粒图谱

附录2 英文缩写词表

致谢

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