培养条件对丹参悬浮细胞中几种活性成份含量的影响

论文摘要

以丹参（Salvia miltiorrhiza）幼叶为外植体诱导愈伤组织，筛选出生长迅速、松散易碎的愈伤组织制备悬浮细胞，获得了较为稳定的悬浮细胞系，并对影响悬浮细胞生长和其有效成分含量的一些因素进行了研究，本结果为丹参的大规模培养提供了基础数据。主要研究内容和结果如下：1以丹参幼嫩叶为外植体，接种于附加2,4-D、NAA、6-BA及其组合的MS固体培养基上，研究外源激素对丹参愈伤组织诱导和生长的影响。结果表明：单独使用三种植物生长调节物质在一定浓度范围内均诱导产生愈伤组织；MS+2,4-D0.5mg/L为丹参愈伤组织诱导的最佳培养基；MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L为最佳增殖培养基；低浓度的2,4-D对丹参愈伤组织的诱导有促进作用，但浓度过高时有抑制作用。2将筛选出的疏松易碎、长势旺盛、颜色鲜黄的愈伤组织接入液体培养基中，研究激素、接种量、碳源、温度及基本培养基等因素对悬浮细胞生长及次生代谢物合成的影响。结果表明：MS+2,4-D0.5mg/L有利于丹参悬浮细胞的生长,6,7-V+2,4-D0.5mg/L有利于丹参悬浮细胞水溶性酚酸的合成；接种量为60g/L；培养温度为24℃；丹参细胞能有效的利用蔗糖并得到较高的丹参酚酸产量；丹参悬浮细胞的生长周期约为18d，在16d时收获细胞可得到最高的生物量和次生代谢物含量。3培养第10d加入诱导子及组合，第16d收获细胞，研究诱导子及其组合对丹参细胞生长及次生代谢物生成的影响。结果表明：过氧化氢、草酸、水杨酸、酵母提取物及其组合均对细胞生长有不同程度的抑制作用；过氧化氢对丹参酚酸和丹参酮的生成均有促进作用，其中10μmol/L的过氧化氢处理的细胞中丹参酚酸含量达到最大值94.85mg/g干重，为对照组的2.43倍；草酸处理对丹参酚酸的生成具有促进作用，但对丹参酮的生成具有抑制作用；1μmol/L的水杨酸处理得到最高的丹参酮含量1.53mg/g干重；酵母提取物及其组合处理在本实验浓度范围内对上述两种成分的促进作用不明显。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 植物的次生代谢及次生代谢产物的研究概况
• 1.1.1 植物次生代谢途径
• 1.1.2 植物次生代谢物质获得途径
• 1.1.3 植物组织培养和细胞培养生产次生代谢产物的研究
• 1.1.4 提高植物次生代谢物产量的方法
• 1.1.4.1 筛选高产细胞系
• 1.1.4.2 培养条件的优化
• 1.1.4.3 诱导子的加入
• 1.1.4.4 前体饲喂
• 1.1.4.5 两段培养法
• 1.1.4.6 两相培养法
• 1.1.4.7 基因工程方法
• 1.2 丹参
• 1.2.1 丹参的资源现状
• 1.2.2 丹参的有效成分及药理作用
• 1.2.3 丹参资源开发及相关生物技术应用研究进展
• 1.2.3.1 丹参的栽培
• 1.2.3.2 丹参的组织培养研究
• 1.2.3.3 基因工程在丹参中的应用
• 1.3 本研究的目的、意义和研究方法
• 第二章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要仪器
• 2.3 主要试剂及溶液配置
• 2.3.1 主要试剂
• 2.3.2 溶液配置
• 2.3.2.1 伊文思兰溶液的配置
• 2.3.2.2 FDA 溶液的配置
• 2.3.2.3 草酸溶液的配置
• 2.3.2.4 水杨酸溶液的配置
• 2.3.2.5 过氧化氢溶液的配置
• 2.3.2.6 酵母诱导子的制备
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 丹参愈伤组织的诱导和增殖
• 2.4.1.1 丹参愈伤组织的诱导
• 2.4.1.2 愈伤组织的细胞增殖
• 2.4.1.3 愈伤组织的生长曲线的测定
• 2.4.2 丹参细胞悬浮体系的建立
• 2.4.2.1 丹参悬浮培养细胞的制备
• 2.4.2.2 激素对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物的影响
• 2.4.2.3 不同接种量对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物的影响
• 2.4.2.4 不同碳源对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物的影响
• 2.4.2.5 不同培养温度对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物的影响
• 2.4.2.6 不同培养基对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物的影响
• 2.4.2.7 丹参悬浮细胞的生长曲线
• 2.4.3 诱导子对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物含量的影响
• 2.4.3.1 不同诱导子对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物含量的影响
• 2.4.3.2 诱导子协同作用对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物含量的影响
• 2.5 分析方法
• 2.5.1 细胞密度的测定
• 2.5.2 细胞活力的测定
• 2.5.3 细胞干重的测定
• 2.5.4 丹参酚酸含量的测定
• 2.5.4.1 样品水溶性酚酸类物质的提取
• 2.5.4.2 定性分析
• 2.5.4.3 定量测定
• 2.5.5 丹参酮总量的测定
• 第三章 实验结果与讨论
• 3.1 愈伤组织的诱导
• 3.1.1 愈伤组织诱导的单因素实验
• 3.1.2 多种植物激素组合试验
• 3.2 愈伤组织的增殖与筛选
• 3.3 愈伤组织的生长曲线
• 3.4 丹参叶愈伤组织中丹参酚酸含量的变化动态
• 3.5 丹参细胞悬浮体系的建立
• 3.5.1 丹参悬浮体系的制备
• 3.5.2 不同激素配比对丹参悬浮细胞生长及水溶性酚酸含量的影响
• 3.5.3 接种量对丹参悬浮细胞生长及水溶性酚酸含量的影响
• 3.5.4 不同碳源对丹参悬浮细胞生长及水溶性酚酸含量的影响
• 3.5.5 不同温度对丹参悬浮细胞生长及水溶性酚酸含量的影响
• 3.5.6 不同基本培养基对丹参悬浮细胞生长及水溶性酚酸含量的影响
• 3.5.7 丹参悬浮细胞生长与次生代谢物合成曲线图
• 3.6 诱导子对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物含量的影响
• 3.6.1 草酸对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物含量的影响
• 3.6.2 过氧化氢对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物含量的影响
• 3.6.3 水杨酸对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物含量的影响
• 3.6.4 酵母诱导子对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物含量的影响
• 3.6.5 酵母提取物与草酸组合对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物含量的影响
• 3.6.6 酵母提取物与水杨酸组合对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物含量的影响
• 3.6.7 酵母提取物与过氧化氢组合对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物含量的影响
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢