稻瘟病菌Rho3与蛋白激酶CK2互作关系及其若干假定互作蛋白的功能分析

论文摘要

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是研究病原真菌生长发育、致病机理以及植物与病原菌互作的重要模式生物。蛋白激酶CK2是真核生物中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在结构上是由两个催化亚基和两个调节亚基组成的四亚基复合体。在稻瘟病菌中CK2由基因MGG 03696编码催化亚基,MGG00446、MGG05651编码调节亚基。基因敲除实验表明CK2的调节亚基在稻瘟病菌的营养生长、孢子形成以及致病性方面均有重要的作用。目前无法得到CK2催化亚基的敲除突变体。生物信息学预测分析可知,稻瘟病菌中CK2与小G蛋白MoRho3之间具有互作关系,酵母双杂交实验验证了这一推论。而CK2与其余小G蛋白Racl,Cdc42, Rhol,Rho2与Rho4之间互作关系不是非常明显,还需进一步验证。同时通过Real-time PCR的方法,验证了在MoRho3突变体中,CK2三个亚基的相对表达量均有不同程度的上升,揭示了两者之间复杂的互作关系。在此基础上,通过生物信息学初步鉴定分析了稻瘟病菌中与MoRho3互作的一些蛋白分子,丰富了两者的调控路径。其中,本研究通过基因敲除的方法重点分析了MGG11744、MGG01279和MGG11243这三个基因的功能,拓展了小G蛋白Rho3的功能网络,为稻瘟病菌中致病性和信号转导规律提供了新的思路和方向。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 CK2的结构特点
• 1.2 CK2的生物学功能
• 1.3 小G蛋白
• 1.4 稻瘟病和稻瘟病菌
• 1.5 稻瘟病菌蛋白激酶CK2与小G蛋白互作研究意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株及植物材料
• 2.1.2 实验培养基
• 2.1.3 生化试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 生物信息学分析
• 2.2.1.1 稻瘟病菌MoCK2蛋白的序列获得及系统进化分析
• 2.2.1.2 稻瘟病菌MoCK2假定互作蛋白的预测
• 2.2.1.3 稻瘟病菌MoRho3相关蛋白的功能预测分析
• 2.2.2 稻瘟病菌cDNA的制备
• 2.2.2.1 稻瘟病菌RNA的提取
• 2.2.2.2 逆转录RT-PCR
• 2.2.2.3 荧光定量PCR
• 2.2.3 AD载体的构建
• 2.2.3.1 PCR扩增目的片段
• 2.2.3.2 PCR产物的回收
• 2.2.3.3 TA克隆
• 2.2.3.4 大肠杆菌感受态的制备和转化
• 2.2.3.5 质粒的提取
• 2.2.3.6 质粒的酶切和连接
• 2.2.4 稻瘟病菌基因组DNA的提取
• 2.2.5 稻瘟病菌基因的敲除和互补
• 2.2.5.1 稻瘟病菌基因敲除原理
• 2.2.5.2 稻瘟病菌基因功能互补原理
• 2.2.5.3 稻瘟病菌原生质体的制备
• 2.2.5.4 稻瘟病菌原生质体转化
• 2.2.5.5 转化子的鉴定
• 2.2.6 稻瘟病菌的表型分析
• 2.2.6.1 稻瘟病菌的生长速度测定
• 2.2.6.2 产孢量测定
• 2.2.6.3 萌发实验
• 2.2.6.4 致病性鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 稻瘟病菌MoCK2蛋白序列的获得及系统进化分析
• 3.2 稻瘟病菌MoCK2的基因敲除与互补
• 3.3 稻瘟病菌MOCK2的功能分析
• 3.3.1 MoCK2调节亚基突变体菌落形态和生长速率
• 3.3.2 MoCK2调节亚基突变体的分生孢子梗
• 3.3.3 MoCK2调节亚基突变体的致病性分析
• 3.3.4 稻瘟病菌中MoCK2假定互作蛋白的预测分析
• 3.3.5 稻瘟病菌中MoCK2与小G蛋白的互作关系
• 3.4 稻瘟病菌中MoRho3相关蛋白的功能分析
• 3.4.1 稻瘟病菌中MoRho3的功能简析
• 3.4.2 稻瘟病菌中MoRho3假定互作蛋白的预测
• 11744的功能简析'>3.4.3 稻瘟病菌中MGG₁1744的功能简析
• 01279的功能简析'>3.4.4 稻瘟病菌中MGG₀1279的功能简析
• 11243的功能简析'>3.4.5 稻瘟病菌中MGG₁1243的功能简析
• 4 讨论
• 5 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢