鸡白细胞介素2受体在RNA病毒感染过程中的免疫调节分析

论文摘要

1、chIL-2R基因的克隆与体外重组表达依据鸡白细胞介素-2受体亚基α链（chCD25）、β（chCD122）、γ（chCD132）的cDNA序列设计特异性引物,通过RT-PCR分别扩增和克隆了chCD25、chCD132 cDNA全长序列及chCD122部分cDNA序列。chCD25和chCD132 cDNA的长度分别为1027 bp和1047 bp,各自编码由211和348个氨基酸（aa）残基所组成的前体蛋白。chCD122 cDNA片段长度为660bp,编码该蛋白的部分胞外区序列。chCD25成熟蛋白由胞外区（172aa）、跨膜区（15aa）和胞浆区（4aa）三部分组成。chCD132成熟蛋白由由胞外区（210aa）、跨膜区（23aa）和胞浆区（94aa）三部分组成。基因定位分析显示,chCD25基因位于鸡染色体1,由五个外显子和四个内含子组成。chCD122基因也位于鸡染色体1,由12个外显子和11个内含子组成。chCD132基因位于鸡染色体4,由8个外显子和7个内含子组成；chCD25和chCD122在基因结构上与人和鼠的相应基因差异较大,而chCD132的则与人、鼠相似。这些结果说明,鸡白细胞介素-2受体（chIL-2R）基因具有明显的种属特异性。将编码chCD25、chCD132的胞外区序列及chCD122部分胞外区序列,分别插入pET32a或pET28a原核表达载体。经酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在1 mM IPTG的诱导下表达4h。SDS-PAGE和Western blot鉴定的结果显示,chCD25、chCD122和chCD132蛋白被表达,它们的分子量大小分别为38KDα、30KDα、28 KDα。通过Ni柱变性纯化的方法,获得纯度较高的chCD25、chCD122和chCD132原核蛋白。2、chIL-2R单克隆抗体制备与功能验证以原核表达的chCD25、chCD122和chCD132重组蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,分别获得了7株（4H5、6C9、6A1、5E1、1G1、6C2、1E1）能稳定分泌抗chCD25单克隆抗体（mAbs）的细胞、4株（1G11,5A5,5B12,2C11）稳定分泌抗chCD122单克隆抗体的细胞、6株（1A1、1G11、1B9、3G11、F8、C10）稳定分泌抗chCD132单克隆抗体的细胞。Western blot检测结果显示,所有抗体细胞分泌的细胞上清均能与相应的重组蛋白发生反应。chIL-2R基因转染真核细胞的免疫细胞化学或荧光检测证实,除chCD122的mAb 5B12和chCD132的mAb 1A1外,所有mAb均能真核细胞表达的chIL-2R蛋白反应。用Con A诱导的体外淋巴细胞增殖试验证实,制备的chCD25 mAbs （5E1和6C9）、chCD122mAbs（5A5、1G11、2C11）及chCD132mAb（C10）能结合淋巴细胞表面的蛋白分子。体外淋巴细胞增殖抑制试验的研究表明,chCD25 mAb 6C9能有效地抑制鸡白细胞介素-2 （chIL-2）激活T淋巴细胞的增殖作用,并呈浓度依赖性。此提示,本文获得的chCD25基因是特异性针对chIL-2的。3、IBDV感染条件下的chIL-2R调节功能分析以IBDV感染鸡胚成纤维细胞,感染后不同时间点,在mRNA和蛋白水平分析chIL-2R及chCD132关联细胞因子的变化。结果显示,IBDV感染能激活CEF中chCD25、chCD122、chIL-2、鸡白细胞介素-4（chIL-4）、鸡白细胞介素-7（chIL-7）、鸡白细胞介素-9（chIL-9）、鸡白细胞介素-15（chIL-15）的mRNA转录显著上调,但CD132的mRNA转录处于抑制状态。与mRNA检测相对应,在IBDV体外感染48小时的CEF可检测到chCD25和chCD122蛋白的表达,不能检测到chCD132蛋白的表达。以致病性IBDV感染SPF鸡,在mRNA和蛋白水平分析chIL-2R及chCD132关联细胞因子的变化,结果显示：胸腺组织中chCD25、chCD122、chCD132、chIL-2、chIL-4、chIL-7、chIL-9、chIL-15的mRNA转录被显著抑制；与胸腺组织相反,法氏囊和脾脏组织中chCD25、chCD122的mRNA转录显著上调,chCD132的mRNA转录上调维持在较低水平,以法氏囊最不明显。与mRNA检测相对应,在IBDV感染的法氏囊及脾脏淋巴细胞表面可检测到chCD25和chCD122的表达,不能检测到chCD132蛋白的表达。这些数据显示,IBDV体内感染显著抑制了胸腺细胞chCD25、chCD122和chCD132亚基的表达,明显激活了法氏囊细胞chCD25和chCD122亚基的表达,但法氏囊细胞chCD132的mRNA基本没有明显变化。因此,我们可以确信,IBDV感染过程中chIL-2R对细胞免疫中枢和体液免疫中枢的调控机制是不同的。在非免疫组织中,IBDV感染后,脑、十二指肠、空肠组织中的chCD25. chCD122、chCD132在感染后表达下调；腺胃、盲肠、肾、肺及胰组织组织中的chCD25、chCD122、chCD132在感染后表达逐渐上调；肌胃组织中的chCD25、chCD122、chCD132处于初期的下调、中期上调和末期下调；肝组织中chCD122和chCD132在感染后表达上调,而chCD25处于初期上调,中末期下调；心组织中chCD132在感染后表达上调,而chCD25处于初期上调、中期下调和末期上调,chCD122处于初期下调,中末期上调。与chIL-2R关联的chIL-4 mRNA转录在脑抑制、在肾上调,chIL-7 mRNA转录在肌胃上调、在腺胃抑制,chIL-2、chIL-7、chIL-9 mRNAs的转录在十二指肠抑制、在盲肠上调,chIL-15mRNA转录在十二指肠上调、在空、盲肠抑制。chIL-2、chIL-7、chIL-9、chIL-15 mRNAs的转录在空肠抑制和在盲肠、心脏上调。这些结果证明,IBDV感染后chIL-2R在不同的非免疫组织的调控机制也是不同的。4、H5N1感染条件下的chIL-2R调节功能分析以H5N1感染CEF,感染后不同时间点,在mRNA和蛋白水平chIL-2R及chCD132关联细胞因子的变化。结果表明,H5N1病毒感染CEF后,能引起细胞内chIL-2R和chCD132细胞因子mRNAs表达上调。IL-2R蛋白水平的间接免疫荧光可检测到chCD25、chCD122和chCD132的表达。此结果显示,IBDV和H5N1感染过程中对chCD132调控是不同的。以H5N1感染SPF鸡,感染后不同时间在mRNA和蛋白水平分析chIL-2R及chCD132关联细胞因子的变化,结果表明,脾脏组织中chCD25、chCD122、chCD132的mRNA明显上调,法氏囊组织中仅出现chCD25和chCD132的mRNA上调,与此相反,胸腺组织中的chCD25、chCD122和chCD132的mRNA均显著下调。免疫组织化学检测也证实,脾脏组织中的chCD25+、chCD122+和chCD132+细胞的数量多于法氏囊组织,胸腺组织中不能检测到chCD25、chCD122+和chCD132+细胞。与之相对应的配体chIL-2、chIL-4在脾脏和胸腺中也出现了显著上调,在法氏囊中出现下调,说明H5N1病毒感染不仅导致了胸腺中chIL-2R+细胞从免疫中枢-胸腺向外周免疫器官的移动,同时启动了机体的TH1和TH2细胞免疫应答。就与chCD132相关联的其他细胞因子而言,chIL-15的mRNA在脾脏、胸腺、法氏囊组织中转录无不明显变化,说明chIL-15未能在机体抵抗H5N1的感染过程中发挥作用。chIL-7的mRNA在脾和法氏囊组织上明显上调,在胸腺中变化不明显,说明H5N1感染过程中chIL-7在维持外周T细胞的自我平衡过程发挥了重要作用。综合上述,H5N1病毒感染引起了免疫中枢chCD25、chCD122和chCD132分子的表达下调,外周免疫组织的上调,导致了chIL-15对chIL-2和chIL-4的调控能力破坏。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 论文创新点
• 研究意义
• 技术路线
• 第一部分 文献综述
• 1 IL-2R的组成及染色体定位
• 1.1 CD25亚基
• 1.2 CD122亚基
• 1.3 CD132亚基
• 2 IL-2R表达
• 2.1 CD25 mRNA及其蛋白的表达
• 2.2 CD122 mRNA及其蛋白的表达
• 2.3 CD132 mRNA及其蛋白的表达
• 3 IL-2R的免疫调节功能
• 3.1 敲除IL-2、CD25、CD122或者CD132转基因鼠的表型
• 3.2 调节性T细胞
• 3.3 CD25阳性B细胞
• 3.4 IL-2R阳性的非淋巴细胞
• 4 IL-2R的信号传导
• 4.1 IL-2和IL-2R信号传导的概况
• 4.2 IL-2R亚基参与信号传导的区域
• 5 CD132的关联细胞因子
• 5.1 II-4
• 5.2 IL-7
• 5.3 IL-9
• 5.4 IL-15
• 5.5 IL-21
• 6 IBDV
• 6.1 IBDV概述
• 6.2 IBDV致病机理
• 7 H5N1
• 7.1 H5N1概述
• 7.2 H5N1的致病机理
• 8 禽IL-2R及CD132关联细胞因子的研究现状及展望
• 参考文献
• 第二部分 研究内容
• 第一章 chIL-2R基因的克隆及体外重组表达
• 1 材料与方法
• 1.1 chIL-2R亚基cDNA的克隆
• 1.2 原核表达重组质粒的构建及序列测定
• 1.3 原核蛋白的诱导表达
• 2 结果
• 2.1 chIL-2R三个亚基基因的RT-PCR及其序列分析
• 2.2 染色体定位及其基因结构分析
• 2.3 chIL-2R原核蛋白的诱导表达与纯化
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 抗chIL-2R单克隆抗体制备与功能验证
• 1 材料与方法
• 1.1 单抗制备
• 1.2 chCD25多抗的制备
• 1.3 特异性和反应性鉴定
• 1.4 chCD25抗体抑制实验
• 2 结果
• 2.1 chCD25蛋白抗体的制备及其鉴定
• 2.2 chCD122蛋白的单克隆抗体制备与鉴定
• 2.3 chCD132蛋白的单克隆抗体制备与鉴定
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 IBDV感染条件下的chIL-2R调节功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 引物的设计
• 1.2 CEF接毒IBDV方案
• 1.3 IBDV病毒感染SPF鸡实验方案
• 1.4 检测感染CEF及鸡组织上IL-2R蛋白的表达
• 2 结果
• 2.1 引物特异性鉴定
• 2.2 chIL-2R及chCD132关联细胞因子在IBDV感染的CEF上表达
• 2.3 chIL-2R及chCD132关联细胞因子在IBDV感染鸡体内表达
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 H5N1感染条件下的chIL-2R调节功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 CEF接毒H5N1方案
• 1.2 H5N1病毒感染SPF鸡实验方案
• 2 结果
• 2.1 chIL-2R及chCD132关联细胞因子在H5N1感染的CEF上表达
• 2.2 chIL-2R及chCD132关联细胞因子在H5N1感染鸡体内表达
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三部分 附录
• 附录A 常用试剂及仪器
• 附录B 常用缓冲液及培养基配方
• 附录C 攻博期间发表或录用的学术论文
• 致谢