大豆蛋白ACE抑制肽的研究

论文摘要

酶法生产生物活性肽不仅有利于充分利用蛋白质资源,而且具有广阔的膳食或药物的应用前景,其中利用大豆蛋白生产降血压肽因其安全、高效性而受到了广泛关注。考虑到疏水性氨基酸对多肽的ACE抑制活性的重要作用,论文研究利用大豆分离蛋白（SPI）的一次水解沉淀,即高分子蛋白片段（high-molecular-weight fraction HMF）制备ACE抑制肽并对具有高活性的组分进行了分离纯化和结构鉴定。论文首先对酶解HMF的条件进行优化研究。结果表明,微波预处理比加热辅助处理更有助于促进HMF水解,且确定最适微波功率为200W,时间为30s。选用Protease N作为适合水解HMF的蛋白酶,其生产ACE抑制肽的最佳水解条件是:底物浓度5%（w/v）,加酶量2%（w/w）,温度55℃,pH值7.0,水解时间120min。在以上的水解条件下HMF的酶解液的ACE抑制活性最高,达到65.1%。同时,研究表明HMF具有较SPI更高含量的疏水性氨基酸和疏水性值。采用截留相对分子质量为5000的膜将粗水解液经过超滤分离,收集流出液,水解物的IC50降低了15.5%,达到了初步纯化的目的。采用DA201-C型大孔吸附树脂能有效脱去HMF水解液中的盐分,同时使用不同浓度的乙醇分级分离,发现高浓度的乙醇对洗脱组分的疏水性氨基酸有富集和分级作用,75%乙醇浓度洗脱下来的组分具有最高的降血压活性,IC50达到0.093 mg·mL-1。经体外消化实验发现,消化道酶作用后ACE抑制活性基本不变。说明经以上步骤制得的ACE抑制肽能较好地抵抗消化道酶作用。采用Sephadex G-15分离75%乙醇洗脱下来的组分,酸性洗脱液:0.2mol·L-1、PH=3.6的醋酸—醋酸钠缓冲液具有较好的分离效果,收集得到ACE抑制活性最高的两个组分,IC50分别为41μg·mL-1和43μg·mL-1组分。其中一个组分经半制备RP-HPLC分离,得到具有最高ACE抑制活性的组分P6-Ⅳ,结合液质联用,分析其一级结构,其氨基酸序列可能是Ser-Trp,IC50值为41.1μmol·L-1。另一组分采用LC/ESI-MS对它的成分进行鉴定,推测其中主要两个组分为大豆异黄酮的化合物,可能分别是6”-丙二酰基异黄酮糖甙和6”-丙二酰基染料木甙或它们的异构体。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 大豆蛋白与其生理活性肽
• 1.1.1 大豆蛋白
• 1.1.2 大豆多肽的生理活性
• 1.1.3 大豆多肽的国内外研究现状
• 1.2 高血压
• 1.2.1 高血压的危害
• 1.2.2 高血压病的治疗
• 1.3 ACE 对血压的调节作用
• 1.4 ACE 抑制肽
• 1.4.1 ACE 抑制肽的结构与功能关系
• 1.4.2 ACE 抑制肽的评价方法
• 1.4.3 源于大豆的ACE 抑制肽
• 1.4.3.1 降血压大豆肽的研究现状
• 1.4.3.2 降血压大豆肽的酶解制备
• 1.4.3.3 存在的问题与难点
• 1.5 立题背景及意义
• 1.6 本论文主要研究内容
• 第二章 酶法水解大豆蛋白制备ACE 抑制肽
• 2.1 前言
• 2.2 材料和仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 成分分析
• 2.3.2 ACE 的提取
• 2.3.3 水解度（degree of hydrolysis, DH）的测定
• 2.3.4 蛋白质或多肽疏水值的测定
• 2.3.5 蛋白酶解制备高分子量组分（HMF）
• 2.3.6 蛋白酶水解HMF 制备ACE 抑制肽
• 2.3.7 对水解液ACE 抑制率的测定
• 2.3.8 氨基酸组成分析
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 SPI 与HMF 的氨基酸组成和疏水性值
• 2.4.2 酶水解HMF 制备大豆肽用酶的选择
• 2.4.3 微波处理对水解效果的影响
• 2.4.4 微波辅助处理与预热处理后加酶水解对比实验
• 2.4.5 Protease N 水解条件的优化
• 2.4.6 水解液ACE 抑制活性与其水解度的关系
• 2.5 本章小结
• 第三章 超滤以及大孔树脂分离ACE 抑制肽
• 3.1 前言
• 3.2 材料和仪器
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 超滤
• 3.3.2 大孔吸附树脂脱盐
• 3.3.3 成分分析
• 3.3.4 ACE 抑制活性的测定
• 3.3.5 ACE 抑制肽的相对分子质量的分布
• 3.3.6 ACE 抑制肽的体外消化稳定性[68]
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 水解液分子量的分布
• 3.4.2 超滤前后水解液的ACE 抑制活性分析
• 3.4.3 HMF 水解液静态吸附
• 3.4.4 大孔吸附树脂静态解吸分级洗脱
• 3.4.5 ACE 抑制肽的体外消化稳定性
• 3.5 本章小结
• 第四章 凝胶过滤以及反相高效液相色谱对ACE 抑制剂的分离纯化及结构分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料和仪器
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 ACE 抑制活性的测定
• 4.3.2 Sephadex G-15 分离纯化ACE 抑制肽
• 4.3.3 不同洗脱液对Sephadex G-15 分离ACE 抑制肽效果的影响
• 4.3.4 半制备RP-HPLC 分离ACE 抑制肽
• 4.3.5 半制备RP-HPLC 进一步分离ACE 抑制肽
• 4.3.6 ACE 抑制肽的液质联用分析
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 凝胶过滤色谱对ACE 抑制肽的分离
• 4.4.2 反相高效液相色谱分离P6
• 4.4.3 LC/MS 鉴定P7 成分
• 4.5 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文