脂肪酶催化合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的研究

论文摘要

L-抗坏血酸脂肪酸酯具有脂溶性抗氧化剂和乳化剂的特性,在食品、医药及妆品行业中具有广泛的用途。酶法合成相比化学法具有反应条件温和、产物安全性高等优点,是一条更为绿色环保的合成路线。然而,经济型底物、酶催化剂的稳定性和生产工艺成为酶法合成发展的限制性因素。本文以棕榈油为酰基供体,对非水相中酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯进行了研究,探索了连续反应工艺,有利于酶法合成技术的工业化。因此,本研究具有一定的学术价值和指导意义。首先,对酶法合成的反应体系进行了考察,确定了以纯有机相作为反应介质。通过对酶促反应各因素的研究,发现溶剂种类和体系水活度（aq）是影响酶促反应的关键因素,溶剂用分子筛充分除水和在反应初始往体系加入适量分子筛,可以有效控制水活度,提高产量。确定了叔戊醇体系中的最适反应条件：20 mL叔戊醇,0.352 gL-抗坏血酸和4.535 g棕榈油,14.2%（w/w,酶/L-抗坏血酸）的酶Novo435,反应初始加入50g/L的4A级分子筛,温度55℃,摇床200 r/min,反应24 h后产物浓度为22g/L。利用响应面实验对影响反应的显著因素进行了优化,得出了最优化条件：酶量为90.32 mg,底物摩尔比9.11,温度55.2℃,理论上最大转化率可达74.31%。然后,采用最优化条件对酶法合成的补料间歇反应工艺进行了研究,确定了补料时间、补料量和补料次数,有效提高了底物、酶的利用效率和单位产量。探索研究了酶的预处理对酶催化效率和稳定性的影响,结果表明,将酶利用叔丁醇和底物浸泡预处理,可以显著提高酶促反应速率。在此基础上,并结合酶重复利用过程中稳定性较差的现象,寻求了一种酶再生方法：利用叔丁醇和棕榈油对酶进行再生,重复使用五批次,酶相对活性仍可以保持为初始的85%,比未再生组提高了1.07倍。该方法提高了酶催化稳定性,降低了催化剂成本。最后,设计了一条酶促合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的连续反应工艺。该工艺中利用乙醇（95%）萃取的方法,将产物和剩余底物棕榈油分离,打破产物积累对反应平衡的限制,然后补加一定量的底物,并重复利用叔戊醇和再生后的酶进行连续催化反应。连续反应五批次（120h）后,产物浓度保持稳定,总转化率保持在65%,与补料间歇工艺相比产量提高了1.36倍。该工艺实现了底物、酶和溶剂的连续使用,降低了生产成本,生产效率提高显著,对酶法合成的工业化应用有一定的指导意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 L-抗坏血酸脂肪酸酯的概述
• 1.1.1 L-抗坏血酸脂肪酸酯的结构与性质
• 1.1.2 L-抗坏血酸脂肪酸酯的应用
• 1.2 L-抗坏血酸脂肪酸酯的合成方法
• 1.2.1 化学合成法
• 1.2.2 酶催化合成法
• 1.3 国内外L-抗坏血酸脂肪酸酯的酶法合成研究进展
• 1.3.1 酶催化合成的影响因素
• 1.3.2 各种L-抗坏血酸脂肪酸酯的研究
• 1.3.3 酶促合成反应工艺的研究
• 1.3.4 产物分离提取的研究
• 1.4 论文研究的目的、意义及主要内容
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究意义与内容
• 第二章 酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的影响因素研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.2 实验仪器
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.3.1 L-抗坏血酸脂肪酸酯的合成
• 2.2.3.2 酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的反应体系确定
• 2.2.3.3 水活度对酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的影响
• 2.2.3.4 酶催化剂的循环使用试验
• 2.2.3.5 加入吸附剂对酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的影响
• 2.2.3.6 产物L-抗坏血酸脂肪酸酯的定性定量分析
• 2.2.3.7 转化率的计算
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的反应体系确定
• 2.3.1.1 两相体系中缓冲液pH对酶促反应的的影响
• 2.3.1.2 两相体系中缓冲液种类的确定
• 2.3.1.3 两相体系中含水量对酶促反应的影响
• 2.3.1.4 微水体系中含水量对酶促反应的影响
• 2.3.1.5 酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的反应体系确定
• 2.3.2 有机相中酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的反应条件考察
• 2.3.2.1 酶种类的筛选
• 2.3.2.2 最佳反应介质的选择
• 2.3.2.3 产物浓度随反应时间变化曲线
• 2.3.2.4 底物浓度对L-抗坏血酸脂肪酸酯合成反应的影响
• 2.3.2.5 有机溶剂的量对L-抗坏血酸脂肪酸酯合成反应的影响
• 2.3.2.6 底物摩尔比对L-抗坏血酸脂肪酸酯合成反应的影响
• 2.3.2.7 加酶量对L-抗坏血酸脂肪酸酯合成反应的影响
• 2.3.2.8 反应温度对L-抗坏血酸脂肪酸酯合成反应的影响
• 2.3.2.9 水活度对L-抗坏血酸脂肪酸酯合成反应的影响
• 2.3.2.10 摇床转速对L-抗坏血酸脂肪酸酯合成反应的影响
• 2.3.2.10 加入吸附剂对L-抗坏血酸脂肪酸酯合成反应的影响
• 2.3.2.11 酶的重复使用试验
• 2.3.3 酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的优化实验
• 2.3.3.1 酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的Plackett-Burman实验
• 2.3.3.2 模型方程的建立与显著性分析
• 2.3.3.3 酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的响应面分析
• 2.3.3.4 模型最佳条件的求取与验证
• 2.4 本章小结
• 第三章 酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的反应工艺研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料与试剂
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 产物L-抗坏血酸脂肪酸酯的定量分析
• 3.2.3.2 分光光度法测定酶催化反应初速率
• 3.2.3.4 萃取过程中产物回收率的计算
• 3.2.3.5 L-抗坏血酸脂肪酸酯的酶法合成补料间歇式工艺
• 3.2.3.6 酶的预处理和酶的重复利用
• 3.2.3.7 L-抗坏血酸脂肪酸酯的酶法合成的连续化反应工艺
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的补料间歇式工艺条件
• 3.3.1.1 第一次补料时间和补料量的确定
• 3.3.1.2 第二次补料时间和补料量的确定
• 3.3.1.3 第三次补料对产物浓度的影响
• 3.3.1.4 补料次数与产物浓度以及转化率的关系
• 3.3.2 酶的浸泡预处理对酶催化效率和稳定性的影响
• 3.3.2.1 酶的预处理对催化反应初速率的影响
• 3.3.2.2 酶的预处理对终产物浓度的影响
• 3.3.2.3 固定化酶重复利用过程中再生方法的确定
• 3.3.2.4 再生温度对酶相对活性的影响
• 3.3.2.5 酶的相对活性随反应批次的变化
• 3.3.3 酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的连续反应工艺
• 3.3.3.1 连续反应过程中产物萃取条件考察
• 3.3.3.2 连续反应工艺中补料量的确定
• 3.3.3.3 连续反应工艺中反应次数与转化率和产物浓度的关系
• 3.4 本章小结
• 第四章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文