论文摘要
背景与目的透明质酸酶（hyaluronidase, HAase）是一类在动物组织和微生物中广泛存在的酶。它可以断开透明质酸（hyaluronic acid, HA）糖链中的N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸之间的糖苷键,将其解聚和水解成低相对分子质量（Mr）HA或寡糖,削弱HA的黏滞性和润滑作用。HAase可促使皮下注射剂或局部积贮的渗出液、血液加快扩散而利于吸收,与一些以缓慢速度进行静脉滴注的药物合用时可改为皮下注射或肌内注射,使药物吸收加快。目前市售的HAase多为从动物（牛、羊）睾丸组织提取的,纯度较低,杂蛋白含量较高,免疫原性较强,增大了治疗的危险性。利用基因工程方法制备将有效解决这些难题。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris, P. pastoris）外源基因表达系统已成功表达了许多胞外和胞内型蛋白质。该系统具有细胞繁殖快、遗传操作简单、易于工业化生产等原核表达系统的优点,又具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力,非常有利于真核基因的表达。我们利用基因工程技术将人ph-20基因转入P. pastoris,制备重组人透明质酸酶PH-20（rhPH-20）,可以提高药物安全性,降低生产成本,减少治疗费用。实验方法将人类ph-20基因进行优化合成,并在两端引入酶切位点XhoⅠ/XbaⅠ,得到克隆质粒pUC57-ph20。再利用双酶切将ph-20基因插入带有AOX启动子和α-信号肽的高效表达载体pPICZa A的多克隆位点,构建pPICZαA-ph20重组质粒,CaCl2法转化E.coli TOP 10进行大量扩增,提取质粒。质粒经酶切、PCR扩增和DNA序列分析鉴定阳性克隆。阳性重组质粒经SacⅠ线性化后,电击转化导入P. pastoris SMD1168H,使基因整合到酵母染色体上。抗生素Zeocin浓度梯度筛选多拷贝菌株。鉴定菌株表型,筛选出甲醇利用型Mut+。对重组菌株进行摇瓶表达,分别经YPD、BMGY、BMMY培养基培养,0.5%甲醇诱导表达。对表达产物中的粗酶进行活性测定,上清液进行SDS-PAGE。分别采用DNS法、DMAB法、浊度法测定样品活性,并对结果进行分析比较,选择最佳方法。筛选产量与活性都较高的重组菌作为工程菌株,1 L发酵罐中甲醇诱导表达rhPH-20,并对发酵条件进行优化,先以甘油为碳源,细胞湿重达200g/L以上时开始甲醇诱导。发酵液离心后上清液进行超滤,浓缩并脱盐。对rhPH-20的部分酶学性质进行研究。结果与结论人类ph-20基因片段全长2009bp,其ORF为1533 bp,编码511个氨基酸,包含信号肽序列（1～35）和疏水锚定区（484～511）。由于基因自身信号肽分泌效果较差,锚定区使蛋白质不溶,我们将这两部分去掉,只选择中间的448个氨基酸序列进行优化并合成,理论Mr为51 kDa。将其插入高效表达载体成功构建pPICZa A-ph20重组表达质粒,首次实现了人ph-20基因在P. pastoris中的表达。抗生素Zeocin浓度梯度筛选多拷贝菌株,最高抗Zeocin浓度为4.5 mg/mL,筛选Mut+表型。通过SDS-PAGE对重组蛋白进行分析,得出Mr约为58 kDa,这是由于糖基化作用,实际Mr比理论Mr大。DNS法与DMAB法的线性范围分别是50～450 U/mL、50-350 U/mL。浊度法的线性范围较小,为0～10 U/mL。3种方法的RSD分别是2.71%、11.71%和0.65%。DNS法适于测定酶活性较高的样品,浊度法适合酶活性较低的样品。摇瓶培养最佳诱导前菌体密度A600=4,甲醇浓度为0.5%,表达时间72 h,最高酶活性达1×104U/L。利用1 L发酵罐对发酵条件优化,诱导前最适菌体量为200g/L,最佳诱导pH为6.0,流加甘油速率控制在0.32 mL/（L-min）,流加甲醇速率为0.13 mL/（L-min）,溶氧维持在20%以上,诱导68 h后酶活达到最高值6×105U/L,总蛋白质表达量为0.307mg/mL,比活为1.954×103U/mg,目的蛋白质占胞外总蛋白质的38%。对rhPH-20的部分酶学性质进行研究：最适反应pH值为6.5,在5.5～6.5范围内时,rhPH-20可保持较高的酶活性；最适反应温度为37℃；Ca2+、Mg2+对酶有激活作用,在0.1～4mmol/L之间时,随浓度升高酶活性增强,随后逐渐减弱。
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