茶树咖啡酸氧甲基转移酶基因的克隆及表达分析

论文摘要

茶树（Camellia sinensis）是重要的木本经济作物之一。木质素是植物界中仅次于纤维素的天然有机资源,茶树体内木质素的含量和各单体比例与茶树抗逆性、茶叶品质等方面有关。咖啡酸氧甲基转移酶（caffeic acid o-methyltransferase,COMT）是木质素生物合成中的关键酶之一。本研究以元宵绿品种为材料,克隆了COMT基因cDNA全长,并进行了原核表达及实时定量分析,以期为将来通过调控该基因的表达量,提高茶树叶片的持嫩性及茶树的抗逆性奠定基础。主要研究结果如下:（1）根据其他作物中已克隆的COMT基因氨基酸序列,设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到317 bp的特异片段,通过RACE法获得茶树COMT基因cDNA,全长为1381 bp,Genbank登录号为HM204933。此基因包含一个长1092 bp的开放阅读框,编码393个氨基酸,5’端非编码区和3’端非编码区分别为77 bp、212 bp。经GenBank数据库Blast分析,其核苷酸序列与欧洲白桦、苎麻、中果咖啡和毛果杨的COMT基因相似性分别为80%、78%、77%、77%,氨基酸序列与毛果杨的COMT基因相似性达到100%。（2）设计特异引物,PCR扩增COMT开放阅读框片段,插入到表达载体pET-32a中,转化表达宿主菌BL21trxB（DE3）,IPTG诱导后高效表达产生分子量约为60 KD的融合蛋白。该融合蛋白包括20 kD的Trx（硫氧还蛋白）和40 kD的COMT蛋白。随着诱导时间的变化,融合蛋白表达量递增,表明COMT基因在大肠杆菌中得到了表达。（3）实时荧光定量PCR结果表明,茶树不同生长阶段的叶片中都有COMT基因的表达,其表达量随着成熟度的增大而增大。（4）通过对水古、浙江紫笋、龙井43、平阳特早四个品种的芽下第一叶中COMT基因的表达量分析得到,其表达量大小依次为龙井43>水古>浙江紫笋>平阳特早,其结果与材料采摘时的成熟程度一致。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 木质素的种类与分布
• 1.2 木质素的生物合成
• 1.3 木质素的生物功能
• 1.3.1 木质素与植物抗逆性
• 1.3.2 木质素对嫁接的影响
• 1.3.3 木质素与绿色农业
• 1.4 氧甲基转移酶（COMT）的研究进展
• 1.4.1 COMT 催化底物的研究
• 1.4.2 COMT 保守区域
• 1.4.3 组织表达特性
• 1.5 研究目的与意义
• 第二章 茶树 COMT 基因 cDNA 全长的克隆
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 茶树RNA 的提取
• 2.2.2 COMT 基因片段的获得
• 2.2.3 COMT 基因全长的获得
• 2.2.4 同源性分析
• 2.2.5 系统进化树分析
• 2.2.6 COMT 蛋白亲水性和疏水性分析
• 2.2.7 信号肽分析
• 2.2.8 二级结构的预测
• 第三章 COMT 基因的原核表达
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 表达载体的构建与重组表达质粒的鉴定
• 3.2.2 融合表达载体pET32a-COMT 在大肠杆菌中的诱导表达和SDS-PAGE 电泳分析
• 第四章 基因表达量分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 同一品种不同成熟度叶子中COMT 的表达
• 4.2.2 不同品种间同一部位的叶子其COMT 的表达情况
• 第五章 讨论
• 5.1 RACE 技术克隆茶树COMT 的优越性
• 5.2 茶树中COMT 在叶片成熟过程中的作用
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介