柽柳eIF1A基因的功能验证

论文摘要

本研究将从抗旱、耐盐、抗寒植物柽柳（Tamarix androssowii）中克隆得到的eIF1A基因,构建到酵母表达载体pYES2中,对其进行酿酒酵母的遗传转化;并对重组酵母进行盐碱胁迫,以验证柽柳eIF1A基因的耐盐性;接着制备了该基因植物侵染的工程菌液,并利用农杆菌介导的叶盘转化法将eIF1A基因导入山新杨基因组中,通过对转基因山新杨的盐碱胁迫试验,对eIF1A基因进行进一步的功能验证。主要实验结果如下:（1）将eIF1A基因与酵母表达载体pYES2连接,获得了pYES-eIF1A重组质粒,并进一步将重组质粒整合到酿酒酵母INSc1菌株中,获得重组酵母INVSc1（pYES-eIF1A）;随机挑选重组酵母的单菌落进行PCR扩增,初步证实eIF1A基因已整合到了酿酒酵母的基因组中。（2）对INVSc1（pYES-eIF1A）和对照菌株进行半乳糖诱导,以研究外源基因eIF1A在酵母中的的表达情况;Northern杂交结果表明,INVSc1（pYES-eIF1A）重组酵母经诱导后能够正确表达。（3）对重组酵母INVSc1（pYES-eIF1A）进行了NaCl、Na2CO3、高温和低温胁迫处理,处理结果证实INVSc1（pYES-eIF1A）酵母的抗逆性明显高于对照INVSc1（pYES2）菌株;初步认为重组酵母处于逆境胁迫时,eIF1A基因的组成型表达增强了酵母在逆境下蛋白质合成的功能,从而增强了酵母对逆境的耐受能力。（4）采用根癌农杆菌介导的转化法对山新杨进行遗传转化,共获得21余株卡那霉素抗性芽,对其进行PCR检测,结果有15株为阳性转基因植株;进一步进行Northern杂交检测,结果表明外源基因能够在转录水平上表达。（5）对5个转基因株系进行了NaCl胁迫处理,分析了逆境胁迫条件下转基因山新杨与非转基因对照的丙二醛（MDA）含量、过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、叶绿素含量和可溶性蛋白等指标的变化。结果表明:NaCl胁迫处理后,各株系的叶绿素含量呈现先下降后上升的趋势,但转基因株系整体上升的幅度大于非转基因对照;各个株系的SOD活性和POD活性明显高于非转基因对照,5个株系中T10株系表现最佳,其SOD活性和POD活性是非转基因对照的1.19和2.77倍;各个转基因株系的可溶性蛋白含量高于对照,其中T6株系表现优秀,其可溶性蛋白含量是非转基因对照的1.76倍;各个转基因株系的MDA含量低于非转基因对照,其中T10株系表现最佳,对照的MDA含量是T10的2.21倍。综合以上结果,eIF1A基因的组成型表达能够不同程度提高转基因山新杨逆境胁迫下的耐受能力,证实eIF1A基因具有提高植物耐盐性的功能;同时综合各个转基因株系几项生理指标的变化,认为转基因株系T10对盐碱胁迫的抗性最强,是理想的耐盐株系,可用作造林树种。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 我国转基因杨树研究概况
• 1.1.1 抗虫转基因研究
• 1.1.2 转抗盐碱基因研究
• 1.1.3 木材材性的改良研究
• 1.2 植物中耐盐基因的种类
• 1.2.1 植物中与耐盐相关的功能基因
• 1.2.1.1 渗透调节物质合成及调节相关基因及其应用
• 1.2.1.2 活性氧清除相关基因及其应用
• 1.2.1.3 直接保护细胞免受盐胁迫伤害的功能蛋白
• 1.2.2 植物中与耐盐相关的调控基因
• 1.2.2.1 转录因子和传递信号基因的作用
• 1.2.2.2 翻译起始因子eIF基因家族
• 1.2.2.3 翻译起始因子eIF1A
• 1.3 本研究的目的意义
• 2 重组酵母INVSc1（pYES-eIF1A）抗逆性分析
• 2.1 引言
• 2.2 试验材料
• 2.2.1 菌株和质粒
• 2.2.2 酶和试剂
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 重组酵母胁迫处理主要试剂
• 2.2.5 主要仪器设备
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 目的基因和载体的获得
• 2.3.2 目的基因和载体的双酶切与纯化
• 2.3.3 重组质粒的构建和转化
• 2.3.4 重组质粒的选择和鉴定
• 2.3.4.1 重组质粒pYES-eIF1A的抗性选择
• 2.3.4.2 重组质粒pYES-eIF1A的PCR扩增检测
• 2.3.4.3 重组质粒pYES-eIF1A的双酶切检测
• 2.3.5 重组质粒的酵母转化及鉴定
• 2.3.6 重组酵母的分子检测
• 2.3.6.1 重组酵母的PCR检测
• 2.3.6.2 重组酵母的Northern印迹杂交
• 2.3.7 重组酵母INVSc1（pYES-eIF1A）的胁迫处理
• 2.3.7.1 INVSc1（pYES-eIF1A）的NaCl胁迫处理
• 2CO₃胁迫处理'>2.3.7.2 INVSc1（pYES-eIF1A）的Na₂CO₃胁迫处理
• 2.3.7.3 INVSc1（pYES-eIF1A）的低温胁迫处理
• 2.3.7.4 INVSc1（pYES-eIF1A）的高温胁迫处理
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 目的基因的获得
• 2.4.2 目的基因和载体的双酶切
• 2.4.3 重组质粒的构建和纯化
• 2.4.4 重组质粒的筛选和鉴定
• 2.4.4.1 重组质粒的抗性筛选
• 2.4.4.2 重组质粒的PCR检测
• 2.4.4.3 重组质粒的双酶切检测
• 2.4.5 重组质粒pYES-eIF1A酵母转化
• 2.4.6 重组酵母的分子检测
• 2.4.6.1 重组酵母的PCR检测
• 2.4.6.2 重组酵母Northern杂交
• 2.4.7 INVSc1（pYES-eIF1A）酵母抗逆性提高
• 2.4.7.1 INVSc1（pYES-eIF1A）酵母的抗NaCl能力增强
• 2CO₃能力增强'>2.4.7.2 INVSc1（pYES-eIF1A）酵母的抗Na₂CO₃能力增强
• 2.4.7.3 INVSc1（pYES-eIF1A）酵母的抗冷能力增强
• 2.4.7.4 INVSc1（pYES-eIF1A）酵母的抗高温能力增强
• 2.5 本章小结
• 3 eIF1A基因山新杨的遗传转化
• 3.1 引言
• 3.2 试验材料
• 3.2.1 植物材料
• 3.2.2 菌株和质粒
• 3.2.3 酶和试剂
• 3.2.4 培养基
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 中间表达载体的获得
• 3.3.2 工程菌的制备和检测
• 3.3.3 山新杨的遗传转化
• 3.3.4 转基因山新杨的分子检测
• 3.3.4.1 转基因山新杨的PCR检测
• 3.3.4.2 Northern印迹杂交
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 中间表达载体的获得
• 3.4.2 工程菌的检测
• 3.4.3 转eIF1A基因山新杨的获得
• 3.4.3.1 eIF1A基因山新杨的抗生素筛选
• 3.4.3.2 转eIF1A基因山新杨的PCR检测
• 3.4.3.3 转eIF1A基因山新杨Northern印迹杂交
• 3.5 本章小结
• 4 转eIF1A基因山新杨的耐盐性研究
• 4.1 引言
• 4.2 试验材料
• 4.2.1 植物材料
• 4.2.2 试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 叶绿素含量的测定
• 4.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
• 4.3.3 过氧化物酶（POD）的测定
• 4.3.4 丙二醛（MDA）含量测定
• 4.3.5 可溶性蛋白的测定
• 4.3.6 盐胁迫下盐害指数的比较
• 4.3.7 数据处理和分析
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 盐胁迫下转eIF1A基因山新杨叶绿素的变化
• 4.4.2 盐胁迫下转eIF1A基因山新杨SOD活性变化
• 4.4.3 盐胁迫下转eIF1A基因山新杨POD活性变化
• 4.4.4 盐胁迫下转eIF1A基因山新杨MDA活性变化
• 4.4.5 盐胁迫下转eIF1A基因山新杨可溶性蛋白含量的变化
• 4.4.6 盐胁迫下转eIF1A基因山新杨盐害指数变化
• 4.5 小结
• 5 讨论
• 5.1 eIF1A基因在转基因山新杨中起的主要作用是增强了蛋白质的合成
• 5.2 杨树核遗传转化的探讨
• 5.3 关于转基因植株的耐盐性及耐盐性鉴定的一些初步认识
• 5.4 山新杨转化
• 5.5 转基因山新杨的筛选
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢