HCV在树鼩原代肝细胞中感染与转染受体辅助感染的研究

论文摘要

丙型肝炎病毒（HCV）是丙型肝炎病的主要病原体。据1999年世界卫生组对于HCV感染情况的调查,全球感染HCV的患者约1.7-2.0亿,我国属于HCV的高度感染区,其感染者约占3.2%。高效病毒体外培养体系与合适实验动物模型的缺乏,是丙型肝炎药物与疫苗研究的主要障碍。2005年,高效的HCV病毒细胞培养体系的建立,可以经过体外培养获得高感染性的HCV病毒,使得动物模型的建立尤为紧迫。除丙型肝炎病毒的自然宿主——人和黑猩猩外,尚未发现其他自然动物对HCV易感。树鼩是一种主要分布于我国云南地区低等灵长类动物。研究发现,树鼩可被HCV患者的血清感染,但是由于HCV患者血清的来源不明、病毒滴度较低、感染不稳定、树鼩个体背景复杂等原因,丙型肝炎病毒对树鼩的感染特性未被最终阐明。本研究以人工驯化、繁育的树鼩为实验对象,采用二步灌流、胶原酶消化法,分离、获得树鼩原代肝细胞（PTH）,优化灌流液、离心速度和培养基,用单因素比较和正交实验法进行比较各优化因素之间的差别,最终以台盼蓝染色法测定获得PTH细胞数量,用MTT法测定PTH的状态。实验确定的最佳灌流液为D-Hank’s、最佳离心速度为800rpm3min、600rpm3min、400rpm2min、最佳培养基配方为1×ITS、1%DMSO、200uM谷氨酰胺、0.15%牛血清白蛋白、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、0.1uM地塞米松和WEM培养基。经过优化的PTH具有更长的生长周期和更好的生长状态,可用于受体分子转染和HCV感染实验。为进一步提高树鼩原代肝细胞对HCV的感染性,将已成功构建可表达人CD81受体的质粒,用脂质体介导转染进入PTH,使树鼩原代肝细胞表达人的CD81分子,用PCR定性和Q-PCR的方法测定出CD81转染后最高表达量约是未转染对照细胞的234倍。最后,采用J6/JFH1-Huh7.5.1培养体系获得的病毒载量为107IU/ml以上的HCV病毒,感染高表达人CD81的PTH,荧光定量PCR法检测培养上清中HCV病毒载量,发现转染和未转染的PTH感染产出的病毒载量基本在104-105IU/ml之间,转染的细胞感染的第7天产出最高病毒载量值为106IU/ml.综上所述,本研究以树鼩为实验动物,采用二步灌流技术得到树鼩原代肝细胞,优化了树鼩原代肝细胞的分离、培养技术,得到了生长时间更长、状态较佳的PTH。将人的CD81转染入PTH中使该细胞能高表达人的CD81,用J6/JFH-1HCV病毒感染转染的细胞,最终用Q-PCR和荧光定量PCR的技术检测转染和未转染细胞感染上清载量,未发现转染所造成HCV感染性增强或病毒增殖能力提高。本研结果为树鼩做为丙型肝炎病毒小型动物模型,奠定了前期研究基础,并有助于HCV感染与复制的机制研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 插图与附表清单
• 英文缩写词表
• 第一章 绪论
• 1.1 丙型肝炎与丙型肝炎病毒
• 1.1.1 HCV生物学特性与致病机制
• 1.1.2 丙型肝炎的诊断和治疗
• 1.2 丙型肝炎动物模型
• 1.2.1 黑猩猩
• 1.2.2 小鼠
• 1.2.3 树鼩作为HCV的小动物模型的研究进展
• 1.3 丙型肝炎体外培养技术
• 1.3.1 HCV亚基因组复制子培养体系
• 1.3.2 HCV细胞培养体系
• 1.3.3 细胞系
• 1.3.4 原代细胞
• 1.4 丙型肝炎入胞机制与受体
• 1.4.1 四个受体及功能机制
• 1.4.2 CD81转染增强感染作用及病毒适应性变异
• 1.5 实验技术路线图
• 第二章 树鼩原代肝细胞的分离培养方法的优化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 实验试剂
• 2.2.4 实验方法的条件优化
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 优化灌流液和离心速度前后树鼩原代肝细胞状态比较
• 2.3.2 优化方法前后树鼩原代肝细胞得量、成活率比较
• 2.3.3 优化方法后树鼩原代肝细胞生长曲线
• 2.3.4 优化方法前后树鼩原代肝细胞存活时间比较
• 2.4 讨论
• 2.4.1 优化方法对树鼩原代肝细胞的分离获得影响
• 2.4.2 优化方法前后树鼩原代肝细胞生长情况的差异
• 2.4.3 分析优化方法后树鼩原代肝细胞生长曲线与形态观察
• 2.5 本章小结
• 第三章 人CD81受体转染树鼩原代肝细胞
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验试剂（试剂盒）
• 3.2.4 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 CD81转染后细胞状态,判断转染试剂对细胞的影响
• 3.3.2 CD81转染树鼩原代肝细胞PCR检测结果
• 3.3.3 CD81转染树鼩原代肝细胞定量PCR检测结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 CD81转染树鼩原代肝细胞定性检测结果分析
• 3.4.2 CD81转染树鼩原代肝细胞相对定量结果分析
• 3.5 本章小结
• 第四章 受体介导HCV感染树鼩原代肝细胞的感染性的变化与分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验试剂（试剂盒）
• 4.2.4 PCR引物
• 4.2.5 实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 转染表达了CD81受体的PTH感染HCV后的上清定量PCR结果
• .4.3.2 比较感染过程中转染的PTH和未转染的上清载量差异。
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录附录
• 附录B 其他需要说明的内容