论文摘要
研究背景:血管新生(从已存在的血管形成新的血管)与许多生理过程和病理变化密切相关,并受到内皮细胞(endothelial cell,EC)迁移、增殖、蛋白水解及细胞分化促进因子和抑制因子的共同调控。最近研究显示,神经营养素家族成员之一神经生长因子(nerve growth factor,NGF)在体外可促进血管EC增殖和迁移,在体内可促进血管新生;但NGF促血管新生的作用是直接作用,还是通过增加血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的分泌而产生的间接作用,仍存在争议。血管新生过程中EC凋亡曾一直被认为是与细胞增殖/生存相抗衡的机制。然而最近的在体及体外证据均提示血管EC凋亡不仅与血管退化有关,而且促进整个脉管系统中多余细胞的去除并导致管腔形成,但其生物学机制仍不清楚。大多数血管生成因子在刺激血管EC增殖和迁移的同时抑制血管EC凋亡。但NGF是诱导还是抑制血管EC凋亡以及NGF是否促进管腔形成尚不清楚。目前认为NGF通过与其两个不同的受体:酪氨酸受体激酶A( tyrosine receptor Kinase A, TrkA)及p75神经营养素受体( p75 neurotrophin receptor,p75NTR)结合发挥生物学作用。NGF通过哪一种受体发挥上述作用有待研究。研究目的:探讨NGF对体外培养的小鼠主动脉环血管新生的影响,对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)凋亡及其在体外形成管腔样结构的影响以及相关受体通路。实验方法:NGF对体外培养的小鼠主动脉环血管新生的影响采用三维基质胶小鼠主动脉环血管新生模型,在含不同浓度NGF的无血清培养基中分别培养不同天数后,对出芽的细胞进行免疫荧光染色细胞学鉴定,或在倒置显微镜下观察、摄像,并以Image Pro图像分析软件计算每高倍视野中平均出芽面积;向培养基中预先加入抗NGF的中和抗体、血管内皮生长因子受体2拮抗剂SU5416或TrkA受体拮抗剂K252a,观察NGF对出芽性血管新生的影响, NGF的促血管新生作用是否依赖于VEGF以及NGF是否通过TrkA受体促血管新生。HUVEC凋亡通过活细胞计数,荧光激活的细胞分选分析膜联蛋白V阳性细胞百分率以及激活型caspase 3免疫荧光染色测定。NGF两种受体TrkA和p75NTR的表达水平通过免疫荧光染色及Western Blot进行评价。以K252a及/或抗p75NTR中和抗体阻断TrkA及/或p75NTR与NGF的结合以明确哪一种受体介导NGF诱导的HUVEC凋亡。基质胶上管腔样结构的形态在相差显微镜下观察、摄像,并以DAPI,鬼笔环肽及激活型caspase 3进行免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察;以Image Pro图像分析软件测量“管腔”面积并用SPSS11.1软件进行统计学分析。实验结果:(1)NGF对体外培养的小鼠主动脉环血管新生的影响:①外源性NGF(0～100ng/ml)呈浓度依赖性促进基质胶中培养的小鼠主动脉环出芽。出芽细胞CD31的表达阳性。抗NGF的中和抗体能明显阻断NGF诱导的出芽性血管新生。②SU5416可显著减少VEGF诱导的血管新生,但对NGF诱导的血管新生无明显影响。③K252a可明显抑制NGF诱导的血管新生。(2)NGF对HUVEC凋亡及其在体外形成管腔样结构的影响:①管腔样结构主要由凋亡细胞组成。②NGF既可诱导HUVEC凋亡又可诱导其在基质胶上形成管腔样结构。③抗NGF中和抗体明显阻断HUVEC自发性或由NGF诱导的管腔样结构的形成。④NGF处理对其两个受体TrkA及p75NTR在HUVEC的表达水平无明显影响。⑤同时阻断TrkA及p75NTR可显著减少NGF诱导的HUVEC凋亡及管腔样结构的形成,但单独阻断其中任何一个受体均无此作用。结论:NGF可通过TrkA受体促进小鼠主动脉环血管新生;TrkA及p75NTR受体共同介导NGF诱导的细胞凋亡;NGF诱导的细胞凋亡可导致HUVEC在体外形成管腔样结构。