希金斯刺盘孢T-DNA插入体库的构建、筛选及相关突变体基因的克隆

论文摘要

希金斯刺盘孢（Colletotrichum higginsianum Sacc.）是十字花科蔬菜炭疽病的病原菌,它属于子囊菌亚门,是一种半活体营养型的病害真菌。本研究以希金斯刺盘孢Ch-1菌株为出发菌株,利用农杆菌介导转化法获得2000多个T-DNA随机插入突变体,为进一步研究病原菌的致病机理提供了必要的材料。通过对突变体进行生物学特性分析,并以拟南芥为寄主植物做致病性测定,对突变体进行了初步筛选并将其分类,其中,2株生长缓慢,菌落不能均匀扩展；4株致病性减弱；3株产孢缺陷,在PDA平皿上不能产生分生孢子；4株产孢量增多；2株可以诱导寄主产生过敏性坏死；13株色素异常；2株菌落扇变；3株附着孢萌发异常。对突变体Pch-1E393和Pch-1C36进行了深入详细的研究。突变体Pch-1E393生长速度明显减慢,菌丝粗壮稀疏,与Ch-1相比差异显著,但对拟南芥的致病力与菌株Ch-1无显著差异,此突变体在侵染过程中能产生正常的黑色附着孢并能产生初生菌丝和次生菌丝。Southern杂交证实在Pch-1E393中T-DNA标记为双拷贝插入。采用反向PCR技术对突变体Pch-1E393中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组序列进行克隆,经过序列分析,表明T-DNA插入破坏的基因包含一个1432bp的完整开放阅读框,包含三个内含子、四个外显子,编码一个352个氨基酸的蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列进行同源性对比（blsatp）,发现该序列与禾生炭疽菌（Glomerella graminicola）的减数分裂重组蛋白DMC1 （meiotic recombination protein DMC1）具有高度同源相似性,相似度为86%,此蛋白在减数分裂过程中参与同源重组。突变体Pch-1C36菌落灰白色,菌落中间呈黑色并塌陷,与Ch-1的菌落形态差异明显,但致病性、生长速度、孢子产量等其他生物特性与Ch-1无明显差异。Southern杂交证实T-DNA标记在Pch-1C36中为双位点插入。采用反向PCR技术对突变体Pch-1C36中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组DNA进行克隆,经过序列分析,表明T-DNA插入破坏的基因包含一个690bp的完整开放阅读框,包含两个内含子、三个外显子,编码一个174个氨基酸的蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列进行同源性对比（blsatp）,发现该序列与endoribonuclease L-PSP （liver perchloric acid-soluble protein）同源性最高,L-PSP是在老鼠中,第一个被鉴定为单链RNA的特异性核酸内切酶。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 希金斯刺盘孢及十字花科炭疽病
• 1.1 希金斯刺盘孢的危害特性
• 1.2 希金斯刺盘孢的营养方式
• 2 炭疽菌研究进展
• 3 拟南芥及植物病原菌与寄主植物的互作
• 3.1 模式植物拟南芥
• 3.2 植物病原菌与寄主植物的互作研究
• 4 农杆菌介导的真菌遗传转化研究
• 4.1 农杆菌介导真菌的遗传转化
• 4.2 农杆菌介导真菌的遗传转化原理
• 4.3 反向PCR（Inverse-PCR）技术的应用
• 选题的目的与意义
• 第二章 希金斯刺盘孢T-DNA插入突变体库的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 希金斯刺盘孢菌株与农杆菌菌株
• 1.1.2 培养基及试剂
• 1.1.3 载体、抗性标记
• 1.1.4 抗生素
• 1.1.5 引物
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 农杆菌培养方法
• 1.2.2 希金斯刺盘孢孢子培养方法
• 1.2.3 ATMT转化方法
• 1.2.4 转化子保存方法
• 1.2.5 转化子的分子鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 农杆菌介导转化希金斯刺盘孢Ch-1菌株
• 2.2 转化子的PCR鉴定
• 3 结论与讨论
• 第三章 希金斯刺盘孢突变体的初步筛选与分类
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验菌株
• 1.1.2 拟南芥植株及培养材料
• 1.1.3 其它试剂材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 转化子菌丝生长速度比较
• 1.2.2 转化子产孢能力比较
• 1.2.3 分生孢子萌发显微观察
• 1.2.4 拟南芥室内种植
• 1.2.5 孢子悬浮液接种拟南芥及侵染过程观察
• 2 结果与分析
• 2.1 野生型与突变体生长速度比较
• 2.2 野生型与突变体菌株产孢量比较
• 2.3 分生孢子萌发显微观察比较
• 2.4 野生型与突变体菌株致病性及侵染观察比较
• 3 讨论
• 第四章 希金斯刺盘孢突变体菌株Pch-1E393和Pch-1C36菌株的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、载体
• 1.1.2 培养基、试剂和抗生素
• 1.1.3 酶类及试剂盒
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 突变体菌株Pch-1E393的形态特征及生长速度测定
• 1.2.2 突变体菌株Pch-1E393和Pch-1C36的孢子产量测定及孢子萌发观察
• 1.2.3 突变体菌株Pch-1E393和Pch-1C36致病性测定
• 1.2.4 突变体菌株Pch-1E393和Pch-1C36侵染观察
• 1.2.5 Southern杂交验证突变体中T-DNA的插入拷贝数
• 1.2.6 Inverse-PCR扩增T-DNA插入位点侧端DNA序列
• 1.2.7 目的片段的回收及连接
• 1.2.8 连接产物的转化
• 1.2.9 重组质粒的提取及PCR鉴定
• 1.3 重组质粒的测序及克隆序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 Pch-1E393及Pch-1C36菌株的形态特征
• 2.2 Pch-1E393及Pch-1C36菌丝生长速度的测定
• 2.3 突变体菌株Pch-1E393及Pch-1C36孢子产量测定及孢子萌发观察
• 2.4 突变体菌株Pch-1E393及Pch-1C36致病性测定
• 2.5 突变体菌株Pch-1E393及Pch-1C36侵染观察
• 2.6 Southern杂交验证突变体中T-DNA的插入拷贝数
• 2.7 反向PCR克隆T-DNA插入位点侧端DNA
• 2.8 侧翼序列全长及相关生物学信息分析
• 3 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢