论文摘要
近年来随着一些抗肿瘤药物脂质体的成功上市,特别是一些新型脂质体结合物理或化学手段提高靶向性及疗效的不断深入研究,人类对攻克肿瘤充满了新的期待。如长循环热敏抗肿瘤脂质体不仅可以延长药物在体内的循环时间,而且还能通过在肿瘤局部加热,促使药物在肿瘤病变部位大量释放,提高疗效并且减小药物对全身的毒副作用。而复方脂质体则可以同时包载两种或多种作用机理不同的抗肿瘤药物而可能发挥协同或相加作用,达到增效减毒的目的。本课题分两部分进行研究:第一部分为盐酸表阿霉素（Epirubicin hydrochloride,EPI）长循环热敏脂质体（long circulating thermosensitive liposomes,LTSL）的研究。首先对模型药物表阿霉素进行了系统的药剂学性质考察,采用了葡聚糖G-50凝胶柱层析法分离脂质体和游离药物,建立了紫外、HPLC等含量测定方法,采用荧光自淬灭法测定热敏脂质体的体外释药特性。考察了药物在不同介质中的溶解状态,初步探讨了脂质体的载药及热敏释药的原理。载入脂质体内相的EPI与缓冲盐形成的胶态沉淀在42℃溶解,并在脂质体发生相变的同时迅速释放出来。而脂质体在低温储存时,由于药物在脂质体内相以稳定的胶态沉淀存在而不易发生泄露。以包封率及体外累积释药量为指标,进行了单因素考察,确定了脂质体的基本处方和工艺。采用pH梯度法载药,不同磷脂比例对脂质体包封率的影响不大（药脂比为1:20时）。但磷脂浓度对脂质体的包封率影响较大,以脂质体理论药物浓度为2 mg·mL-1为例,当磷脂浓度从75 mg·mL-1降至30 mg·mL-1时,脂质体的包封率由99%降至80%。加入少量DSPG既可以提高脂质体的稳定性又不影响脂质体的相变温度。MSPC及DSPG在处方中的比例对热敏脂质体的释药影响较大,随着MSPC含量的增加或DSPG含量的减少,脂质体的释药量增加。以药脂比、DPPC/MSPC及水化介质浓度为影响因素,以37℃及42℃热敏累积释药量为指标进行正交实验优化了脂质体的处方和工艺,其中水化介质的浓度对热敏释放影响较大。最优处方为药脂比1:10,DPPC/MSPC为82:8,水化介质为250mM pH4.0柠檬酸盐;最优工艺为脂质体15000psi均质6次,挤压过100nm聚碳酸酯膜3次,控制粒径<100nm。建立了HPLC法测定制剂的有关物质,方法专属性良好。三批最优处方制备的脂质体理化性质如下:药物含量2.4mg·mL-1,有关物质2.6%,包封率>99%,粒径<100nm,pH 7.67.7,DSC图谱显示相变温度为42.8℃左右。在体外热敏实验中,脂质体在37℃水浴15min释药不足5%,而在43℃水浴下,4min内体外累积释药达到90%以上。EPI-LTSL放样稳定性试验结果表明,4℃和-20℃储存150d包封率和pH均无明显变化,粒径分别增大约20nm和50nm,含量分别下降了约9.6%及2.9%。EPI-LTSL用生理盐水和5%葡萄糖10倍稀释放置2h后粒径和包封率无明显变化,用新生牛血清等体积稀释后37℃放置24h后粒径增大20nm,包封率下降约1.5%。进行水溶性药物脂质体的冻干并且保持较高的包封率和较小的粒径变化是脂质体研究的一个难题。试验中通过调整处方、筛选冻干保护剂及冻干程序而制备了符合要求的EPI-LTSL冻干脂质体。处方中加入适量的DSPG,可减小冻干脂质体用水复溶时因发生聚集而导致的粒径增大。试验中发现冻干保护剂在脂质体内外相的浓度对产品冻干后的性状和复溶的速度以及复溶后的稳定性影响显著。优选脂质体内外相的乳糖浓度均为9%,冻干品颜色均匀,呈鲜亮的橘红色或红色疏松块状结构,纯水复溶迅速,粒径增大较小,且基本无药物泄露。试验中还发现预冻和冻干程序也可影响产品性状及复水的快慢,中速预冻及缓慢的解吸干燥得到的脂质体冻干品外观较好,表面平整无塌陷。进行了大鼠体内药动学实验,建立了盐酸表阿霉素体内样品分析方法,采用LC-MS进行样品的测定,该方法简单、快捷,最低定量限可达到10ng·mL-1。体内结果表明,静脉注射相同剂量(12mg·kg-1)的EPI溶液、EPI-LIP及EPI-LTSL后,药物在体内快速分布,较缓慢消除,均符合三室模型。采用DAS2.0软件进行数据处理,EPI-LTSL的t1/2α、t1/2β、t1/2γ、AUC、MRT分别是EPI溶液组及EPI-LIP组的7.8,1.3,12.6,15.1、6.2倍及1.6,1.4,12.3,3.0,3.6倍,而后两组的CL约为EPI-LTSL组的14倍。可见EPI-LTSL能显著延长药物在体内的循环时间。采用小鼠皮下Lewis肺癌肿瘤模型,以EPI非热敏长循环脂质体（Non-thermosensitive long circulating liposomes, NTSL）和EPI注射液为对照组,生理盐水为空白组,进行三次静脉给药。绘制了肿瘤生长曲线和体重变化曲线,称取瘤重并计算抑瘤率。药效学试验结果表明:EPI-LTSL组、EPI-NTSL、注射液组均与生理盐水组的瘤重有极显著性差异（P<0.01）,EPI-LTSL组与EPI-NTSL组或注射液组的抑瘤率之间有显著性差异（P<0.05）,而EPI-NTSL组与注射液组间没有显著性差异（P>0.05）。其中EPI-LTSL组、EPI-NTSL组及注射液组的抑瘤率分别为61.1%,39.6%,43.1%。并且注射液组小鼠体重相比两个脂质体制剂下降更多,可见EPI-LTSL较EPI注射液的药效增强而毒性减小。组织病理学结果表明EPI-LTSL试验组肿瘤较非热敏长循环脂质体和注射液组坏死较彻底,而各实验组小鼠心肌均未见明显异常,可能是累积给药量较小的原因。第二部分为表阿霉素-紫杉醇（TAX）复方脂质体的研究。首先考察了EPI与TAX单独或联合使用时对人乳腺癌细胞体外细胞生长抑制作用,采用金氏公式计算联合作用效果。实验表明人乳腺癌细胞MCF-7,ZR75-1对EPI的敏感性均明显高于TAX,两药单独使用时,不同浓度的EPI与TAX对MCF-7细胞或ZR75-1细胞的抑制率呈明显的时间依赖性,且两药联合使用在高浓度下(>1μg·mL-1)对上述两种细胞的生长抑制有相加作用。采用薄膜分散-pH梯度法将两个理化性质相差较大的抗肿瘤药按临床联合用药比例共同包载于脂质体中,制备复方脂质体,进行了处方和工艺的优化并建立了同时测定EPI与TAX的HPLC方法。复方脂质体中TAX与EPI的含量分别为0.83mg·mL-1和0.27mg·mL-1,包封率分别为95%和99%,粒径100nm左右。进行了高低两个剂量的荷瘤小鼠药效学试验,结果表明:在高剂量治疗时(TAX 30mg·kg-1,EPI 10mg·kg-1),复方脂质体组相比两个单方脂质体制剂组对肿瘤生长抑制有相加作用,但无论是高剂量治疗还是低剂量治疗时(TAX 15mg·kg-1,EPI 5mg·kg-1)复方脂质体组和物理混合脂质体组的抑瘤率之间均没有显著性差异（P>0.05）。本课题第一部分制备的表阿霉素长循环热敏脂质体（EPI-LTSL）工艺稳定、热敏释药性质良好,初步探讨了该制剂的热敏释药规律。EPI-LTSL不仅显著延长药物在体内的循环时间,并具有良好的热敏靶向性,可在局部加热的条件下使药物在肿瘤组织局部浓集,提高了小鼠Lewis肿瘤的治疗效果,减小了全身的毒副作用。虽然表阿霉素普通脂质体和长循环脂质体均有文献报道,但表阿霉素长循环热敏脂质体的体内药动和药效研究未见国内外文献报道。第二部分对表阿霉素-紫杉醇（TAX）复方脂质体进行了初步的研究。建立了同时包载脂溶性药物和水溶性药物的复方脂质体的制备工艺,且两药的包封率均较高,并且首次建立了同时测定EPI和TAX的HPLC方法,该复方制剂的研究未见文献报道,考察了EPI与TAX单独或联合应用对人乳腺癌细胞MCF-7,ZR75-1对EPI的敏感性,计算了联合作用效果,并进行了不同剂量组的小鼠体内药效学实验,该部分研究未见文献报道。本课题对热敏脂质体处方进行了系统的考察,并进行了长循环热敏脂质体及复方脂质体的体内外评价,为盐酸表阿霉素新剂型的研究进行了有益的探索,为药物新制剂的临床开发和应用提供参考。
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