水通道蛋白在细胞运动中的功能研究

论文摘要

水通道蛋白（aquaporin,AQP）是一类存在于细胞膜上的水通透性蛋白,在哺乳动物各种组织细胞中广泛分布,自从九十年代红细胞膜上的水通道蛋白（AQP1）被发现以来,目前在哺乳类已发现至少有13个成员（AQP012）,大量研究表明,AQP在多种器官的生理和病理中发挥重要作用。近期研究发现的水通道蛋白在细胞迁移和血管新生中的重要作用,为细胞迁移的分子机制增加了新的内容,也为水通道基因功能研究开启了一个新的领域。肿瘤细胞的迁移是肿瘤浸润和转移的关键步骤。目前已知水通道蛋白在多种类型的肿瘤细胞中表达,水通道蛋白在肿瘤细胞迁移中的作用目前国内外均未见报道,我们推测水通道蛋白可能在肿瘤细胞迁移活动中发挥重要作用。本研究发现水通道蛋白介导的细胞膜高水通透性促进肿瘤细胞迁移。对高转移性SMMC-7221人肝癌细胞系进行系统的RT-PCR、免疫荧光和免疫印迹分析,发现水通道蛋白AQP1表达。进一步分析发现SMMC-7221细胞系含细胞膜具有高水通透性（SMMC-7221hPf）和低水通透性（SMMC-7221lPf）的两个亚群,分别与细胞膜AQP1表达量相一致。SMMC-7221hPf细胞的穿孔迁移速率和平面迁移率均显著高于SMMC-7221lPf,而细胞的贴附和增殖能力没有显著差别。AQP1腺病毒感染SMMC-7221lPf细胞提高了细胞膜AQP1表达、细胞膜水通透性和细胞迁移速率。上述结果显示,水通道蛋白AQP1介导的细胞膜高水通透性促进SMMC-7221人肝癌细胞细胞的迁移并且可能参与肿瘤的浸润和转移过程。为了进一步研究水通道蛋白在细胞迁移活动中的作用,我们利用基因打靶技术制作了对氯离子高度敏感的EYFP-V163S绿色荧光蛋白转基因小鼠。通过对EYFP-V163S转基因小鼠各组织器官体内原位灌注并监测其荧光的动态变化,我们可以直接测定各个组织细胞膜的水通透性;同时我们可以体外培养表达EYFP-V163S的各组织细胞,研究水通道蛋白在这些不同类型细胞迁移活动中的表现特征;另外,我们还可以在小鼠活体动物模型中研究水通道蛋白在白细胞参与抗肿瘤、抗感染过程中的作用及水通道蛋白在胚胎发育、组织损伤修复等诸多与细胞迁移相关的重要生理病理活动中的作用。

论文目录

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英文摘要

第一章水通道蛋白在肿瘤细胞运动中的功能研究

第一部分引言

一、水通道蛋白的发现、命名及分类

二、水通道蛋白的分子结构

（一）水通道蛋白的初级结构

（二）水通道蛋白的高级结构

三、水通道蛋白的组织细胞分布及表达调控

四、水通道蛋白的生理功能研究

（一）水通道在呼吸系统的功能研究

（二）水通道在消化系统的功能研究

（三）水通道在泌尿系统的功能研究

（四）水通道在神经系统中的功能研究

（五）水通道在眼球生理中的功能研究

（六）水通道在皮肤及肌肉生理中的功能研究

（七）水通道参与细胞迁移活动的功能研究

五、水通道蛋白在未来基础研究和临床应用前景

六、本研究的目的与意义

第二部分实验材料与方法

一、实验材料

（一）主要生化和分子生物学试剂

（二）质粒及载体等

（三）细胞系

（四）细菌菌株

（五）主要实验仪器及耗材

二、实验方法

（一）细胞培养

（二）稳定转染和水通透性测定

（三）细胞的 RT-PCR 检测

（四）免疫荧光

（五）免疫印迹

f / hP_f细胞的表达'>（六）腺病毒介导AQP1 在SMMC-72211P_f / hP_f细胞的表达

（七）细胞贴附及增殖能力检测

（八）细胞穿孔迁移实验

（九）平板单层细胞损伤愈合实验

（十）统计分析

第三部分实验结果

一、EYFP-H148Q-V1635 质粒稳定转染各肿瘤细胞结果

（一）稳定表达 V1635 绿色荧光蛋白的肿瘤细胞

（二）细胞水通道功能功能荧光检测分析

（三）细胞的RT-PCR 检测结果

（四） Immunofluorescence 及 Western blot 鉴定结果

二、腺病毒介导 AQP1 在 SMMC-7221 细胞的表达

（一）人 AQP1 腺病毒转移载体（pENTER-AQP1）的构建

（二）人AQP1 重组腺病毒表达载体的构建

（三 A）QP1 重组腺病毒滴度的测定

（四）腺病毒介导 AQP1 的表达

三、细胞贴附及增殖能力检测结果

四、细胞钻孔迁移实验结果

五、细胞损伤愈合实验结果

第四部分讨论

第五部分结论

第二章 EYFP-V1635 转基因小鼠模型的建立

第一部分引言

一、绿色荧光蛋白及其突变体的分子特性

（一） GFP 的分子结构特性及发光机制

（二） GFP 的光谱特性

（三） GFP 的改进

（四 E）YFP-V1635 的分子特性

二、动物转基因与基因打靶

（一）动物转基因研究概况

（二）转基因动物制备方法简介

（三）基因打靶（Gene targeting）技术的应用

三 R、OSA26 基因位点的特性及其在动物转基因中的应用

四、本研究的目的及意义

第二部分实验材料与方法

一、实验材料

（一）主要化学及生化试剂

（二）培养基

（三）血清

（四）酶类

（五）细胞系

（六）细菌菌株

（七）实验仪器及耗才

二、实验方法

（一）培养基及溶液的配制

（二）打靶载体的构建及制备

（三） STO 滋养层细胞的培养

（四） E14 胚胎干细胞的培养及转染

（五）胚胎的显微操作

（六）转基因小鼠的鉴定与传代

第三部分实验结果

一、ROSA26Targeting-EYFP-V1635 打靶载体的构建

（一）ROSA26Targeting-EYFP-V1635 打靶载体的构建策略

（二）ROSA26Targeting-EYFP-V1635 打靶载体的构建结果

二、ES 细胞筛选鉴定果

三、转基因小鼠的鉴定

第四部分讨论

第五部分结论

参考文献

主要英文缩写词表

致谢

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