重金属镉离子抗原合成与单克隆抗体的制备

论文摘要

随着人们生活水平的不断提高和环保意识的增强,对重金属污染尤为关注,残留检测急需加强。但常用的重金属检测方法需依靠大型仪器,大都存在样品处理繁琐、费用高、检测时间长等缺陷。本研究利用鳌合剂螯合Cd2+、偶联载体蛋白体外合成Cd2+免疫抗原和检测抗原;利用紫外分光光度法、三硝基苯磺酸法、以及抗血清效价检测对其进行评估;利用单克隆抗体制备技术初步建立镉离子的ELISA检测方法;旨在为重金属Cd2+的残留检测提供一种方便、准确、特异、低廉、快速的新技术。结果:（1）合成抗原紫外吸收峰与载体蛋白紫外吸收峰有明显差异,游离氨基含量在33%～40%之间。（2）100μg/只剂量免疫小鼠后,抗血清效价明显高于50、200μg/只剂量免疫的小鼠,抗血清效价在1:81 920以上。（3）50%的PEG,SP2/0与小鼠脾细胞细胞比例为1:7.1时,融合率高达98.4%。（4）用BSA-IEDTA-Cd和BSA-IEDTA检测细胞上清,筛选出了2孔阳性杂交瘤细胞1A1和4E7,阳性率为0.35%;经3次阳性率100%的克隆后只获得了抗Cd2+的杂交瘤细胞株1A1。（5）利用已建立的间接竞争ELISA法检测发现,1A1细胞上清效价在1:1 024以上,腹水效价高于1:256 000。（6）腹水蛋白浓度为15.04 mg/mL,单克隆抗体为IgG1。结论:（1）IEDTA可以用于重金属Cd2+免疫抗原或检测抗原合成的螯合剂。（2）KLH作为免疫抗原的载体蛋白,免疫效果优于以BSA为载体蛋白;BSA用于检测抗原载体蛋白,可以降低成本,检测结果也相对稳定。（3）合理的免疫方案有助于产生高效价的抗血清,免疫效果与免疫剂量间无正相关性。（4）实验虽已制备出抗Cd2+的单克隆抗体,但细胞融合阳性较低,克隆不够稳定,抗原合成工艺尚需进一步优化。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 前言
• 1 重金属污染现状
• 1.1 我国土壤的重金属污染现状
• 1.2 我国农作物的重金属污染现状
• 1.3 重金属对淡水资源的污染
• 1.4 重金属对水产生物的污染
• 1.5 重金属对中草药的污染
• 2 重金属常规检测方法
• 2.1 原子吸收光谱法
• 2.2 原子荧光光度法
• 2.3 电感耦合等离子体质谱
• 2.4 电感耦合等离子体原子发射光谱
• 3 重金属免疫学检测方法
• 4 鼠源单克隆抗体的原理
• 4.1 单克隆抗体技术
• 4.2 单克隆抗体的制备程序
• 4.3 单克隆抗体的优点
• 5 实验目的和意义
• 实验研究
• 1 材料
• 1.1 实验动物与饲料
• 1.2 细胞株
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 主要试剂配制
• 2.2 抗原制备
• 2.3 抗原鉴定
• 2.4 小鼠免疫与抗血清制备
• 2.5 间接ELISA 检测小鼠抗血清方法的建立[59,60]
• 2.6 免疫小鼠抗血清检测
• 2.7 细胞融合
• 2.8 间接ELISA 筛选方法的建立
• 2.9 杂交瘤细胞上清的检测
• 2.10 杂交瘤细胞株的建立
• 2.11 阳性杂交瘤细胞的扩大培养与细胞上清效价的检测
• 2.12 单克隆抗体亚类的鉴定
• 2.13 阳性杂交瘤细胞的冻存与复苏
• 2.14 腹水型单克隆抗体的大量制备及浓度的测定
• 2.15 腹水型单克隆抗体的纯化
• 2.16 腹水纯化前与纯化后的效价检测
• 2.17 腹水型单克隆抗体纯化后的SDS—PAGE 电泳
• 3 结果与分析
• 3.1 抗原蛋白浓度
• 3.2 免疫抗原和检测抗原紫外分析
• 3.3 免疫抗原和检测抗原游离氨基浓度
• 3.4 间接ELISA 方法建立
• 3.5 小鼠抗血清效价
• 3.6 细胞融合时各细胞比例数
• 3.7 细胞融合率
• 3.8 筛选方法的建立结果
• 3.9 阳性杂交瘤细胞株筛选
• 3.10 阳性杂交瘤细胞株的建立
• 3.11 阳性杂交瘤细胞上清效价
• 3.12 抗体亚类鉴定
• 3.13 单克隆腹水效价及腹水浓度检测结果
• 3.14 单克隆腹水纯化与分析
• 3.15 单克隆抗体的SDS—PAGE 电泳
• 4 讨论
• 4.1 完全抗原的合成影响因素
• 4.2 完全抗原鉴定
• 4.3 间接竞争ELISA 检测方法的建立
• 4.4 小鼠免疫
• 4.5 杂交瘤细胞融合
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介