玉米负重力性生长相关基因LAZY1的克隆及功能分析

论文摘要

植物体的负向地性生长是一个非常复杂的过程，它在保持植株的株型，减轻倒伏的危害并提高种子的产量等方面具有重要的作用。尽管人们对植物体重力向性生长的机制研究取得了很多的进展，但是该过程的具体机制还不明了。玉米lazy1突变体早在1936年就已被发现，该突变体在胚芽鞘时期负地性生长能力部分缺失，但是在形成成熟个体后，则完全失去负重力生长能力。与野生型相比，突变体的胚芽鞘中生长素分布状态发生变化，但是重力感受细胞中的淀粉体形态正常，因此LAZY1可能在重力信号传导途径中具有重要的作用。对LAZY1的深入研究，具有重要的理论与实践意义。通过同源性分析，本研究发现玉米负地性生长缺失突变体lazy1-1与lazy1-2，都在基因位点（LOC100276689）处发生缺失突变且该位点的基因与水稻LAZY1基因同源。生物信息学预测结果表明，LAZY1只存在于植物界且在N端含有一个跨膜结构域。通过生物信息学预测及亚细胞定位分析表明，LAZY1只存在于植物界中，且定位于细胞膜与细胞核上。酵母双杂交的结果表明，LAZY1和参与生长素响应的转录抑制因子AUX/IAA家族成员发生互作。AUX/IAAs家族是生长素调节下游基因表达的重要成员，可以与转录激活因子ARFs（Auxin Response Factors）形成异源二聚体。生长素与受体泛素连接酶SCFTIR1结合后，促使转录抑制因子AUX/IAAs的泛素化降解，释放出ARFs进而启动相关基因的表达。LAZY1的功能缺失，可能影响到该途径中的重要环节，使受生长素特异性调节的基因表达异常，影响植株的重力反应过程。另外，与LAZY1发生互作的蛋白质还有类蛋白激酶C蛋白和钙周边蛋白结合蛋白。蛋白激酶C是一种在磷酸肌醇信号转导途径中发挥重要作用的组分，该激酶的激活需要钙离子以及膜脂DAG的参与，当DAG在质膜中出现时，胞质溶胶中的蛋白激酶C被结合到质膜上，然后在Ca2+的作用下被激活。钙周边蛋白结合蛋白也是一种和Ca2+信号相关的蛋白，可能参与Ca2+依赖性的泛素化途径。有研究证明，磷酸肌醇信号途径在植物的向性反应中起重要的作用，同时生长素外排蛋白PIN1的亚细胞定位还受到胞内Ca2+浓度的影响，因此LAZY1可能是通过磷酸肌醇信号途径来调节某些基因的表达，或者影响某些生长素极性运输载体的亚细胞定位，来调控植株的重力反应过程。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 植物体重力感受机制的研究进展
• 1.1.1 重力反应的过程
• 1.1.1.1 植物体对重力刺激的感知
• 1.1.1.2 信号转导与传递
• 1.1.1.3 植物体弯曲
• 1.1.2 LAZY1 基因的研究历史及现状
• 1.2 蛋白质互作研究技术介绍
• 1.2.1 酵母双杂交技术
• 1.2.2 免疫共沉淀技术
• 1.2.3 GST-Pulldown 技术
• 1.2.4 双分子荧光互补技术
• 1.2.5 荧光共振能量转移（FRET）技术
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与载体
• 2.1.3 酶
• 2.1.4 主要引物
• 2.1.5 生化试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 LAZY1 基因序列的同源分析
• 2.2.2 基因组 DNA 的提取
• 2.2.3 总 RNA 的提取
• 2.2.4 质粒的提取
• 2.2.4.1 大肠杆菌质粒提取
• 2.2.4.2 酵母质粒的提取
• 2.2.5 载体的构建
• 2.2.5.1 亚细胞定位载体的构建
• 2.2.5.2 酵母双杂交诱饵载体的构建
• 2.2.6 PCR
• 2.2.6.1 常规 PCR
• 2.2.6.2 菌落 PCR
• 2.2.6.3 Site-Finding PCR
• 2.2.7 基因枪转化洋葱表皮瞬时表达
• 2.2.7.1 实验材料准备
• 2.2.7.2 DNA 包裹钨粉微粒
• 2.2.7.3 基因枪轰击操作
• 2.2.8 琼脂糖凝胶电泳与显色
• 2.2.8.1 琼脂糖凝胶的制备
• 2.2.8.2 电泳及显色
• 2.2.9 酵母双杂交文库的构建及评价
• 2.2.9.1 玉米材料处理与总 RNA 的提取
• 2.2.9.2 双链 cDNA 的合成与短片段的去除
• 2.2.9.3 酵母双杂交“Mate & Plat”文库的构建
• 2.2.9.4 文库的库容量及质量评价
• 2.2.10 酵母双杂交文库的筛选与分析
• 2.2.10.1 诱饵酵母与文库酵母的配合
• 2.2.10.2 阳性克隆验证与分析
• 2.2.11 部分试剂的配制
• 3 结果与分析
• 3.1 玉米 LAZY1 基因的克隆与鉴定
• 3.1.1 玉米 B73 中 LAZY1 基因序列的同源分析
• 3.1.2 突变体中 LAZY1 基因序列的克隆与验证
• 3.2 生物信息学预测
• 3.3 LAZY1 的亚细胞定位结果
• 3.4 玉米胚芽鞘负向地生长时期的酵母双杂交文库的构建及评价
• 3.4.1 玉米胚芽鞘重力反应过程及 RNA 的提取
• 3.4.2 双链 cDNA 的合成与小片段 cDNA 的去除
• 3.4.3 酵母双杂交“Mate & Plat”文库的构建及质量评价
• 3.5 LAZY1 的酵母双杂交筛选结果
• 3.6 阳性克隆的分析
• 4 讨论
• 4.1 LAZY1 基因的克隆与分析
• 4.2 玉米胚芽鞘负地性生长时期的酵母双杂交文库的构建及评价
• 4.3 酵母双杂交文库的筛选
• 4.4 进一步的研究计划
• 5 结论
• 参考文献
• 7 附录
• 7.1 B73 与突变体 lazy1-1 中 LAZY1 基因的序列
• 7.2 突变体 lazy1-2 中 LAZY1 基因的序列
• 8 致谢
• 9 攻读硕士学位期间发表的论文