青岛文昌鱼SRA基因的克隆、表达及进化分析

论文摘要

文昌鱼属于脊索动物门中的头索动物业门,处于由无脊椎动物到脊椎动物的过渡位置。作为从无脊椎动物到脊椎动物过渡阶段的典型动物,文昌鱼一直是研究动物进化和胚胎发育的模式动物。SRA基因是一种类固醇激素受体的转录辅激活因子,也是首次发现的可以从RNA和蛋白质两个水平上发挥作用的分子。目前,对SRA基因的研究主要集中在在脊椎动物中,而在进化上占据关键位置的文昌鱼中是否存存在SRA基因还不清楚。本论文首先通过5’-RACE技术克隆了青岛文昌鱼SRA基因,命名为AmphiSRA。 AmphiSRA基因序列全长1542bp,含有一个525bp的最大开放阅读框（ORF）,编码有174个氨基酸组成的蛋白质,推测其分子量约为19.5kDa。5’端含有一段165bp的非翻译区（UTR）,3’端含有一段852bp的非翻译区。序列经NCBI BLASTP程序比对,发现其具有完整的SRA基因家族编码框。我们利用Northern杂交的方法,对AmphiSRA基因是否在青岛文昌鱼中存存和大小进行了鉴定。杂交结果显示出三条条带,大小分别约为4kb,1.6kb和500bp,我们得到的cDNA与其中一条大小一致。利用整体原位杂交检测文昌鱼的成体切片以及各时期的胚胎发现,AmphiSRA广泛分布于文昌鱼各个组织中,在脊索、神经索、鳃、肠以及卵巢和精巢中表达尤其明显,并且胚胎和成体中的表达情况-致。AmphiSRA是否属于表达蛋白质类型,我们通过构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达来解决这一问题。通过对重组菌株的SDS-PAGE,我们发现AmphiSRA确实如我们推测的那样,属于可以表达蛋白质的业型。经过His-tag抗体进一步的Western杂交鉴定,确实得到了特异性表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1 文昌鱼背景介绍
• 2 SRA基因的研究现状
• 2.1 类固醇激素受体
• 2.2 SRA基因的发现
• 2.3 SRA基因的作用对象
• 2.4 SRA基因与受体作用部位
• 2.5 SRA的功能
• 2.5.1 RNA形式的功能
• 2.5.2 SRA蛋白质形式的功能
• 3 主要内容、研究意义及技术路线
• 第二章 青岛文昌鱼SRA基因的克隆及生物信息学分析
• 1 前言
• 2 试验材料
• 2.1 成体文昌鱼
• 2.2 质粒和菌株
• 2.3 试剂及溶液
• 2.3.1 试剂
• 2.3.2 培养基
• 2.4 试验用主要仪器
• 3 试验方法
• 3.1 总RNA的提取
• 3.1.1 一步法提取成体文昌鱼总RNA
• 3.1.2 甲醛变性胶电泳检测提取的RNA
• 3.2 RACE扩增青岛文昌鱼SRA基因
• 3.2.1 青岛文昌鱼5’-cDNA文库的构建
• 3.2.2 青岛文昌鱼SRA基因的基因扩增
• 3.2.3 PCR片段的纯化
• 3.3 青岛文昌鱼SRA基因的克隆和测序
• 3.3.1 连接反应
• 3.3.2 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
• 3.3.3 热激转化
• 3.3.4 筛选阳性克隆及测序
• 3.4 基因组扩增青岛文昌鱼SRA基因
• 3.4.1 文昌鱼基因组的提取
• 3.4.2 文昌鱼SRA基因的基因组扩增
• 3.5 载体pcDNA3.0-SRA的构建
• 3.5.1 提取载体pcDNA3.0和目的片段所在载体质粒
• 3.5.2 载体pcDNA3.0和目的片段所在载体质粒的双酶切
• 3.6 Northern blot
• 3.6.1 DIG标记探针的合成
• 3.6.2 RNA探针效率检测
• 3.6.3 转膜
• 3.6.4 杂交
• 3.6.5 杂交后洗膜及显色
• 4 结果
• 4.1 总RNA的提取
• 4.2 RACE扩增青岛文昌鱼SRA基因
• 4.3 青岛文昌鱼SRA基因基因组结构
• 4.4 青岛文昌鱼SRA基因生物信息学分析
• 4.4.1 NCBI BLASTP
• 4.4.2 CLUSTAL W
• 4.4.3 青岛文昌鱼SRA基因进化树分析
• 4.5 RNA探针的合成和效率检测
• 4.6 青岛文昌鱼SRA基因Northern blot
• 5 讨论
• 第三章 青岛文昌鱼基因的原位杂交及时空表达分析
• 1 前言
• 2 试验材料
• 2.1 成体文昌鱼和胚胎
• 2.2 质粒和菌株
• 2.3 试剂及溶液
• 2.4 仪器设备
• 3 方法
• 3.1 青岛文昌鱼总RNA提取
• 3.2 青岛文昌鱼SRA基因DIG标记探针的合成
• 3.3 青岛文昌鱼SRA基因DIG标记探针效率检测
• 3.4 石蜡切片
• 3.5 整体原位杂交
• 3.6 胚胎原位杂交
• 4 结果
• 4.1 整体原位杂交检测SRA基因在成体各组织中的表达
• 4.2 整体原位杂交检测SRA基因在文昌鱼胚胎不同发育时期的时空表达
• 5 讨论
• 第四章 文昌鱼SRA基因的融合表达及Westenr blot检测
• 1 前言
• 2 试验材料
• 2.1 质粒和菌株
• 2.2 试剂及溶液
• 2.3 培养基
• 2.4 主要仪器设备
• 3 试验方法
• 3.1 SRA与pET28a载体的双酶切
• 3.1.1 青岛文昌鱼SRA基因的引物设计与PCR扩增
• 3.1.2 SRA基因PCR产物及表达载体pET-28a的双酶切
• 3.2 青岛文昌鱼SRA基因的克隆和测序
• 3.3 融合蛋白诱导表达
• 3.4 重组蛋白Western blotting鉴定
• 3.4.1 转膜
• 3.4.2 封闭
• 3.4.3 一抗孵育
• 3.4.4 二抗孵育
• 3.4.5 显色
• 4 结果
• 4.1 SDS-PAGE结果
• 4.2 Western blot结果
• 5 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录