基于活性指纹技术的海洋真菌MNP801活性成分的研究

论文摘要

本研究通过分子活性定点识别技术,即通过HPLC技术与抗氧化活性或抗肿瘤活性筛选联用技术,初步定向测定海洋真菌浸膏活性部分的极性区域,从而为海洋真菌代谢产物的分离过程提供了一定的指导作用,在此基础上对海洋真菌的次级代谢产物进行系统的分离纯化工作,最后得到了具有生物活性的海洋真菌代谢产物,以此作为筛选海洋真菌代谢产物中的活性成分的指导方法。本实验得出以下几点主要结论:（1）实验菌种MNP801是由实验室从东海北纬31.3622度,东经122.6896度海域40 m深处海水样品,通过多次稀释涂布法分离得到多株的海洋真菌中,选取两株MNP801海洋真菌,其中一株通过18sDNA鉴定为链格孢属Alternaria sp.MNP801,将其大规模培养,分离菌体和发酵液,提取物菌体浸膏。另一株通过初步生化和形态学鉴定为海洋毛霉属真菌Mucor sp.MNP801,用其进行特定天然产物生物转化研究。（2）首次通过HPLC技术与抗氧化活性或抗肿瘤活性筛选联用技术建立海洋真菌Alternaria sp.MNP801的定点活性谱图。在抗氧化模型中,主要通过测定DPPH自由基清除活性来评估每个极性区段的化合物的抗氧化活性。在抗肿瘤定点活性模型的建立中,分别测定了对PC-12、H460、A549和3T3等4株肿瘤细胞的抑制活性,经过筛选发现其对肿瘤细胞H460和3T3的抑制活性相对显著,最后将抑制H460和3T3细胞株活性结合作为分离抗肿瘤活性化合物的依据。（3）基于已建立的抗氧化和抗肿瘤分子定点识别谱图,通过确定的最佳HPLC条件,采用中压制备仪直接进行菌体浸膏中目标微量分子的定点分离,最终从菌体浸膏中分离到化合物1-3,分别为5α,8 a-表二氧麦角甾-6,22-二烯-3 β醇（1）、氧杂蒽酮（2）、硬脂酸（3）。化合物1为首次从海洋链格孢属真菌中分离得到的化合物,经过测定化合物1对肿瘤细胞H460和3T3显示了较好的抑制活性,其IC50值分别为51.26±0.21μg·mL-1和41.26±0.18μg·mL-1。（4）首次通过海洋真菌Mucor sp.MNP801转化柳叶腊梅中分离的天然产物6,7-二甲氧基香豆素,采用GC-MS等仪器分析转化组与对照组发酵液中的可挥发性成分,发现转化组中出现对照组没有且异于加入底物的新产物2-乙酰-4-乙酰氨基-5-硝基苯酚,并非此海洋真菌本身所产生的次级代谢产物,为通过海洋真菌得到新的活性物质的研究提供了一种可以借鉴的方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 论文中术语、缩略语一览表
• 第一章 绪论
• 1.1 海洋微生物研究的背景和意义
• 1.2 海洋真菌活性代谢产物研究进展
• 1.2.1 萜类
• 1.2.2 肽类
• 1.2.3 生物碱类
• 1.2.4 醌酮类
• 1.2.5 酯类
• 1.3 微生物药物的高通量筛选
• 1.4 本课题立题背景、意义
• 1.5 本课题研究内容
• 第二章 海洋真菌Altemaria sp.MNP801的大规模培养和菌种鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 海洋真菌Altemaria sp.MNP801的复苏与斜面培养
• 2.2.3 海洋真菌Altemariia sp.MNP801的18sDNA基因组鉴定[51]
• 2.2.4 海洋真菌Altemaria sp.MNP801的大规模培养及提取物制备
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 海洋真菌Altemaria sp.MNP801显微镜下菌丝及孢子形态
• 2.3.2 海洋真菌Altemaria sp.MNP801的18sDNA基因序列鉴定结果
• 2.3.3 菌体浸膏薄层色谱层析（TLC）
• 2.4 本章小结
• 第三章 海洋真菌Altemaria sp.MNP801菌体浸膏活性分子定点识别谱的建立
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 菌体浸膏HPLC条件的确定
• 3.2.3 HPLC-DPPH自由基清除活性联用
• 3.2.4 HPLC-MTT抗肿瘤活性联用
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 Altemaria sp.MNP801菌体浸膏DPPH自由基清除活性分子定点识别谱的建立
• 3.3.2 菌体浸膏抗肿瘤活性分子定点识别谱的建立
• 3.4 本章小结
• 第四章 海洋真菌Altemaria sp.MNP801菌体中活性微量次级代谢产物的定点分离和鉴定及生物活性的测定
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 海洋真菌Altemania sp.MNP801菌体浸膏活性分子定点识别技术的建立
• 4.2.3 结构鉴定
• 4.2.4 DPPH自由基清除活性测定
• 4.2.5 肿瘤细胞生长抑制活性测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 分子活性定点识别谱图筛选海洋真菌Alternaria sp.MNP801菌体浸膏次级代谢产物
• 4.3.2 结构鉴定
• 4.3.4 化合物的生物活性
• 4.4 本章小结
• 第五章 海洋毛霉属真菌Mucorsp.MNP801转化天然香豆素后的挥发性成分研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 实验菌种
• 5.2.2 生物转化目标化合物
• 5.2.3 培养基组成及培养条件
• 5.2.4 样品处理
• 5.2.5 气相色谱-质谱联用（GC-MS）
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 挥发性成分定性分析
• 5.3.2 挥发性成分的定量分析
• 5.3.3 挥发性成分的比较与分析
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 6.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况