论文摘要
干细胞（stem cell）是一类具有自我复制和分化潜能的未分化细胞,在适宜的条件下或给予适宜的信号,可以分化为不同类型的具有特征性形态、特异分子标志和特殊功能的成熟细胞。根据分化潜力的不同,干细胞可以分为全能干细胞（totipotential stem cell）、多能干细胞（multipotential stem cell）和单能干细胞（unipotential stem cell）。胚胎干细胞具有发育的全能性,可分化为人体所有的组织和细胞,是全能干细胞。成体干细胞或组织干细胞,具有组织特异性,能分化产生所属组织的细胞类型,是多能或单能干细胞。这一发现不仅对于细胞生物学理论的发展有着重大的意义,对于各种因素导致的组织和器官缺损性、退行性疾病以及先天缺陷性疾病的细胞移植替代治疗也具有深远的影响。神经干细胞（neural stem cell,NSC）具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能,能自我更新,从胚胎和成年动物的室下区、纹状体、海马及脊髓等部位已成功地分离培养出了这种干细胞。近年来,神经干细胞或导入特定基因的神经干细胞移植治疗神经损伤和神经退行性疾病的研究取得了重大进展。神经管（neural tube）是中枢神经系统的原基,构成神经管壁的神经上皮细胞（neuroepithelial cell）是最原始的神经干细胞,又称神经上皮干细胞（neuroepithelial stem cell,NESC）。其数量多、易提取,移植后有较强的存活和向神经细胞方向分化的能力,因此在细胞移植治疗神经系统疾病方面较其它来源的神经干细胞更具优势。无神经节细胞性巨结肠病（aganglionic megacolon）又称先天性巨结肠病（Hirschsprung’s disease,HD）,是一种严重危害婴幼儿健康的先天性畸形,其发病率高达1/3000～1/5000。其主要病理变化是一段结肠壁内缺乏神经节细胞,致使该段结肠持续性痉挛,肠腔狭窄,其近端肠腔扩张,内容物潴留。其主要临床表现是腹胀,顽固性便秘,不完全性肠梗阻。手术切除狭窄段结肠并进行端一端吻合是目前唯一有效的治疗方法。但由于手术损伤和结肠缩短,术后常出现小肠结肠炎、稀便、患儿心理障碍等后遗症,如果累及直肠下段或进行大段结肠切除,还会引起大便失禁和代谢紊乱。多年来的研究证明,肠壁内存在着一个由神经节细胞和神经纤维构成的、相对独立的神经调节网络,调节消化管的运动功能,称肠神经系统（entericnervous system,ENS）。肠神经节细胞由神经嵴细胞迁移、分化而来。神经嵴位于神经管背外侧,与神经管同源,同属神经干细胞。在人胚发育的第5-12周,神经嵴细胞迁入原始消化管,并在此分化为神经节细胞和神经胶质细胞,在肠壁的环形肌与纵形肌之间形成肌间神经丛,在粘膜下形成粘膜下神经丛。如果神经嵴细胞不能迁入原始消化管,或迁入的神经嵴细胞不能分化为肠神经节细胞,就会引起无神经节细胞性巨结肠病等消化管神经运动障碍性疾病。基于上述理念,我们设计了该项研究课题,即在无神经节细胞性巨结肠病的大鼠模型上,探讨神经上皮干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的可行性,为该病的治疗开辟一条新路。实验分三部分进行:第一部分神经上皮干细胞的分离培养和体外标记神经上皮干细胞的分离培养和体外标记是进行干细胞移植的前提条件。经多次试验,我们成功地摸索出了一个分离培养、体外标记神经上皮干细胞的最佳方案。从孕11.5天的Wistar大鼠胚胎中分离神经管,机械吹打后获得单细胞悬液,接种于无血清培养基DMEM/F12(含B27),并加入碱性成纤维细胞生长因子静置培养。72小时后开始出现许多十几个细胞聚集形成的细胞团,呈悬浮状态,即神经球。第6天每个细胞集落由几十甚至几百个细胞聚集形成,Nestin染色呈强阳性。将神经球置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行分化培养7天后进行微管相关蛋白2（microtubule associated protein 2,MAP2）和胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）免疫细胞化学染色,染色结果显示,神经上皮干细胞能分化为MAP2阳性的神经细胞及GFAP阳性的胶质细胞。通过进一步的RT-PCR检测,显示培养的神经上皮干细胞在体外表达肠神经营养因子受体系统rearranged during transformation（RET）receptortyrosine kinase和GFRα1（GDNF family receptorα1）,说明这种细胞可接受肠壁环境中的生长因子信号的调控,更有利于移植后向肠神经细胞方向分化。为了移植后可以在体内示踪,我们在体外对细胞进行了5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU）标记,于移植前3d在细胞中掺入BrdU,经BrdU免疫细胞化学染色,神经球中有大约90%的细胞呈BrdU阳性,为下一步的移植实验提供了良好的示踪标记细胞的方法。第二部分无神经节细胞性巨结肠病动物模型的建立建立无神经节细胞性巨结肠病的动物模型是进行细胞移植治疗实验研究的基本条件。为此,我们根据无神经节细胞性巨结肠病的病理变化,以大鼠为实验动物,选用阳离子表面活性剂—苄基-二甲基-十四烷基氯化铵（benzalkoniumchloride,BAC）作为神经细胞的选择性灭活剂,作用于大鼠的远段结肠浆膜表面,选择性的灭活肠神经节细胞,成功地建立了该病的动物模型。术后4周大体解剖发现,BAC作用处肠管痉挛狭窄,其上方肠管扩张、肠内容物潴留;结肠测压球囊扩张刺激反射实验显示无神经节细胞段结肠的反射性收缩消失;HE染色、免疫荧光染色及组织化学染色证实,BAC作用处肌间和粘膜下神经节细胞消失,乙酰胆碱酯酶的活性明显减低;Western blot也证实神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase,nNOS）和胆碱乙酰转移酶（cholineacetyltransferase,ChAT）的表达明显降低。证明了该动物模型与人类的无神经节细胞性巨结肠病类似,为进一步研究该病的发病机理和治疗方法提供了适宜的动物模型。第三部分无神经节细胞肠壁内神经上皮干细胞的移植和移植后的检测在成功建立动物模型的基础上,我们进行了神经上皮干细胞的移植。取BrdU标记的第5代的神经上皮干细胞,移植到模型鼠去除肠神经节细胞的肠段。移植4周时检测发现,移植细胞存活良好,并部分分化为蛋白基因产物9.5（proteingene product 9.5,PGP9.5）阳性的神经细胞和GFAP阳性的星形胶质细胞。移植8周后移植细胞分化成为nNOS及ChAT阳性的神经细胞。结肠测压球囊扩张刺激反射实验显示细胞移植后肠神经反射性收缩恢复,肠离体肌条试验结果也表明神经上皮干细胞移植组结肠较未移植细胞的模型组结肠有明显的EFS诱导的舒张或收缩反应。这提示神经上皮干细胞在肠壁的微环境中可以存活,并分化为功能性的肠神经细胞,而且可恢复无神经节细胞结肠段的神经运动功能。结论本项研究成功地分离培养、鉴定和标记了神经上皮干细胞,成功地建立了无神经节细胞性巨结肠病的大鼠模型,并成功地进行了肠壁内干细胞移植,通过移植后的检测,证明了移植细胞在肠壁中能够分化成功能性的肠神经细胞,并能恢复肠神经运动功能。这表明神经干细胞肠壁内移植有望成为治疗无神经节细胞性巨结肠病的新方法。
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