论文摘要
原发性肝癌（主要是肝细胞肝癌,hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见的恶性肿瘤之一,预后极差,目前是世界第三位癌症杀手,而在中国则高居第二位。手术切除仍是治疗肝癌最有效的方法,但由于肝癌的一些特性,如多灶性,早期血管侵犯,合并肝硬化等,只有不到20%的肝癌患者就诊时适合手术治疗。放射治疗（以下简称放疗）用于肝癌的治疗已有半个世纪,近年随着适形放疗技术的出现及放射生物学观念的更新,放疗在肝癌治疗中的地位有所提高。但临床观察到即使接受根治剂量放射治疗后,仍有60%以上的患者有残存肿瘤存在,尽管放疗后肿瘤会缩小甚至消失,病情得到控制或缓解,但缓解期过后不少病人很快出现复发转移,而且进展迅速,预后较差。这一现象从临床上提出了许多问题,如放疗是否会促进残余肿瘤的播散转移,出于何种机制,如何干预以减少放疗后的复发转移并最终提高放疗疗效,等等。本课题即为此而设计,主要应用我所建立的转移性人肝癌MHCC97L裸鼠模型,模拟临床分割放疗,并主要观察放疗后残余肝癌的侵袭转移潜能的变化。通过实验新发现放疗结束后期残余肝癌的侵袭转移潜能增强,其机制主要是通过上调TMPRSS4表达从而诱导上皮一间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）实现的。EMT是指上皮细胞向间质细胞转化的复杂过程,在此过程中上皮细胞的极性消失,迁移和运动能力增强,EMT是上皮来源的恶性肿瘤发生侵袭转移的重要原因。我们还发现放疗后单独使用TMPRSS4的抑制剂AEBSF或合并使用小剂量IFN-α和阿司匹林（Aspirin）可减少放疗后的肝内播散和转移,从而为进一步提高肝癌放疗疗效提供了线索。1.放射线照射可引起肝癌细胞MMP-2、VEGF表达增加及体外侵袭性增强,并与放射线剂量及时间相关分别以不同剂量的6mvX线照射MHCC97L细胞,各照射组吸收剂量分别为4Gy和8Gy,对照组（0Gy）除不接受X线照射外,其他处理与照射组相同。照射后24-48h MHCC97L细胞MMP-2和VEGF的表达或活性增强并与照射剂量及时间相关,组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。8Gy照射后48h其表达及活性最强,此后逐渐降低,照射后96h MMP-2活性低于非照射组。放射线照射对MHCC97L细胞体外侵袭能力的影响:0Gy（对照组）、4Gy和8GyX线照射后,MHCC97L细胞穿过Matrigel胶到达Transwell小室膜背面的细胞数分别为7.2±1.9、13.2±2.7和31.2±7.2,组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。放射线照射后96h,各组细胞穿膜数无显著差异（P＞0.05）。提示放射线照射可使MHCC97L细胞体外侵袭性短期增强。2.Aspirin能抑制放射线照射后肝癌细胞MMP-2和VEGF的表达、活性及体外侵袭性的增强体外放射线照射前2h细胞培养基内加入Aspirin,使其终浓度为2mM,放疗后继续培养48h。在不抑制细胞增殖的前提下,与对照组相比,Aspirin能在mRNA水平和蛋白水平抑制放疗诱导的VEGF和MMP-2的表达增加和MMP-2活性的增强,以及由此导致的肝癌细胞侵袭性增强。3.放疗结束后残余肝癌体内侵袭转移潜能的变化规律为了在体内进一步验证放疗结束后残余肝癌侵袭转移能力的变化,我们将具有肺转移潜能的人MHCC97L肝癌组织块种植于BALB/c nu/nu雄性裸鼠肝脏,建立转移性人肝癌裸鼠原位模型。待种植后4周瘤体直径1cm左右时开始放疗。周一至周五每天照射2Gy,共计2周,总放疗剂量20Gy。分别于放疗结束后2天和30天处死放疗组及其对照组裸鼠,切除残余肝癌组织再次原位种植于正常裸鼠肝脏,观察6周处死。放疗结束后2d残余肝癌及其对照组肝癌切除再种植肿瘤大小分别为1.61±0.51cm3和2.25±0.52cm3（P＜0.05）,肺转移率分别为12.5%和66.7%（P＜0.05）,而放疗结束后30d残癌及其对照组肝癌切除再种植肿瘤大小分别为和2.60±0.61cm3和2.15±0.71cm3（P＞0.05）,肺转移率分别为100%和63.6%（P＜0.05）。提示放疗结束后2d残癌生长受到抑制,而放疗结束后30d肿瘤生长速度已恢复到放疗前,甚或过之。放疗结束后30d残癌切除再种植后肿瘤在肝内呈播散性生长,肺转移率增加;而放疗结束后2d残癌切除再种组肿瘤呈外生性生长,无肝内播散,肺转移率降低。提示放疗结束后残余肝癌在体内的侵袭转移能力先减弱后增强。4.放疗结束后不同时段残余肝癌组织肿瘤侵袭转移相关基因表达差异的研究为了寻找放疗结束后残余肝癌在体内侵袭转移能力变化的相关机制,我们采用Super Array肿瘤侵袭转移相关基因芯片,对对照组、放疗结束后2d和放疗结束后30d残余肝癌组织肿瘤侵袭转移相关基因的表达谱进行分析。以上调或下调超过2倍为检测标准。与对照组相比,放疗结束后2d残余肝癌组织抑癌基因Kiss1和TIMP2表达上调。而放疗结束后30d残余肝癌组织癌基因TMPRSS4表达上调,抑癌基因BAI1表达下调。5.实时荧光定量PCR验证基因芯片结果和Western blot分析TMPRSS4在放疗前后不同时段的表达我们采用实时荧光定量PCR法验证基因芯片的结果。结果显示放疗结束后2d残癌组织Kiss1（P＜0.01）和TIMP2（P＜0.05）的mRNA表达显著增强,而放疗结束后30d残癌组织TMPRSS4 mRNA表达显著高于对照组及放疗结束后2d残癌组织（P＜0.01）,而BAI1mRNA表达变化无统计学意义（P＞0.05）。由于放疗结束后30d残余肝癌的侵袭转移能力增强是影响放疗疗效的关键,我们用Western blot进一步验证放疗前后不同时段肝癌组织内TMPRSS4的蛋白含量,同样发现放疗结束后30d残癌组织内TMPRSS4蛋白含量显著高于对照组及放疗结束后2d肝癌组织。提示放疗结束后期TMPRSS4表达增加是其侵袭转移增强的重要原因。6.Western blot分析EMT相关分子及COX-2的变化根据文献报道,TMPRSS4表达增强能够抑制E-cadherin从而诱导EMT,我们进一步用Western blot检测上皮细胞的标志E-cadherin和其转录抑制因子SIP1,以及间质细胞的标志Vimentin和N-cadherin,发现放疗结束后30d残癌组织SIP1、Vimentin和N-cadherin的表达明显增加,E-cadherin的表达则显著减少。而TMPRSS4抑制剂AEBSF能抑制放疗诱导的SIP1和TMPRSS4的表达而增强E-cadherin的表达,提示放疗结束后30d残癌侵袭转移能力增强是通过上调TMPRSS4的表达,从而抑制E-cadherin和引起EMT实现的。此外,我们选取部分基因芯片未包括的与肿瘤侵袭转移相关的基因进行分析。Western blot结果显示,放疗结束后30d残癌组织COX-2的表达明显增强,由于COX-2的表达与E-cadherin负相关,因此COX-2表达增强也有助于EMT的发生。7.联合使用小剂量IFN-α和Aspirin或绿脓杆菌制剂能抑制肝癌在裸鼠体内的生长转移据我所前期实验结果,大剂量（1.5×107U/kg·d）长期使用IFN-α能有效抑制转移性人肝癌裸鼠模型肿瘤的生长,并降低手术切除后的复发转移率。但部分患者长期使用大剂量IFN-α会出现白细胞减少等副作用,不能坚持使用影响疗效。鉴于放疗结束后期COX-2表达增加,我们选择联合使用IFN-α和COX-2抑制剂Aspirin观察其对肝癌在裸鼠体内生长转移的抑制作用。结果显示小剂量IFN-α（7.5×106U/kg·d）+Aspirin（15mg/kg·d）可显著抑制肝癌在裸鼠体内的生长转移,其疗效与单独使用大剂量IFN-α（1.5×107U/kg·d）无显著差异。此外,结果还显示绿脓杆菌制剂腹腔注射也可通过促进肿瘤细胞凋亡而显著抑制肿瘤生长转移。为此我们选择小剂量IFN-α（7.5×106 U/kg·d）+Aspirin（15mg/kg·d）和绿脓杆菌制剂作为干预放疗结束后期残余肝癌侵袭转移增加的治疗手段。8.联合使用小剂量IFN-α和Aspirin或绿脓杆菌制剂可降低放疗结束后期的肝内播散和转移将放疗结束后30d残癌组织切除再种植于裸鼠肝脏,分为对照组、小剂量IFN-α+Aspirin治疗组和绿脓杆菌制剂治疗组。与对照组相比,小剂量IFN-α+Aspirin治疗组和绿脓杆菌制剂治疗组肝内播散显著减少,而肺转移被完全抑制。Western blot及免疫组化结果显示小剂量IFN-α+Aspirin治疗组可显著减少放疗后残癌组织内的COX-2的表达,而增强E-cadherin的表达,从而逆转放疗结束后期TMPRSS4表达增强所诱导的EMT及侵袭转移的增加,显示出小剂量IFN-α和Aspirin在减少放疗结束后期残癌侵袭转移方面的临床应用价值。结论1.放疗结束后残余肝癌体内侵袭转移潜能随时间变化先降低后增强。2.放疗结束后残余肝癌TMPRSS4表达增加,进而抑制E-cadherin的表达和诱导EMT,是放疗结束后期残余肝癌侵袭转移能力增强的主要原因。3.联合使用小剂量IFN-α和Aspirin或单独使用TMPRSS4抑制剂AEBSF能有效抑制放疗后期COX-2和TMPRSS4表达的上调,增加E-cadherin的表达,抑制残癌的侵袭转移。绿脓杆菌制剂亦可通过促进肝癌细胞的凋亡来抑制放疗后的播散转移。4.联合使用小剂量IFN-α和Aspirin可成为临床肝癌患者放疗后减少复发转移有效实用的干预措施。应用价值1.明确放疗后残余肝癌体内侵袭转移潜能变化规律及其机制,有助于指导放疗后的综合治疗,从而降低放疗后肝癌的复发转移。2.联合应用小剂量IFN-α和Aspirin可显著降低放疗结束后期残癌在体内的侵袭转移,为临床提高肝癌放疗的疗效提供了线索。3.联合应用小剂量IFN-α和Aspirin可显著抑制肝癌的生长转移,有可能成为临床肝癌治疗的新方法。创新点1.首次发现放疗结束后残余肝癌体内侵袭转移潜能的变化规律及其机制,提出放疗后残癌TMPRSS4表达增加,进而抑制E-cadherin的表达和诱导EMT,是放疗结束后期残癌侵袭转移能力增强的主要原因。2.首次提出联合应用小剂量IFN-α和Aspirin可显著抑制肝癌的生长转移并降低放疗结束后期残癌的侵袭转移。
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