新型抗菌肽AWRK6优化构建及在毕赤酵母的表达

论文摘要

抗菌肽（antibacterial peptides, ABP）又称抗微生物肽（antimicrobial peptides, AMP）或肽抗生素（peptide antibiotics）,是生物机体为对抗外源性病原体及恶性细胞,由免疫防御系统非专一性应答产生的一类小分子活性肽类的总称。抗菌肽通常是由10-50个氨基酸组成的小分子多肽,具有抗菌谱广、热稳定性强、分子量小及免疫原性小等特点,其杀菌机制独特,不易产生耐药菌,有望开发为新一代肽类抗生素。国外对蛙类抗菌肽的研究已有数十年历史,目前已有肽类抗生素进入临床试验阶段。东北林蛙作为主要分布在我国东北地区的两栖动物,其皮肤抗菌肽分子水平的研究尚处于起步阶段,仅有零星序列的报道。天然抗菌肽尽管有很多其他抗生素无法比拟的优势,但也有其缺陷性。某些天然抗菌肽在杀菌的同时具有溶血性,还有一些抗菌肽本身具有生物毒性,无法应用于临床治疗。因此对天然抗菌肽的改造也是当前抗菌肽研究的新方向。目前对抗菌肽改造的分子设计方案主要是分析天然抗菌肽的生化性质,根据已知影响活性的因素,设计出新的抗菌肽。或者通过比较已知抗菌肽的结构,找出保守序列,筛选出具有优良抗菌活性的新的抗菌肽。Dybowskin-2CDYa（SAVGRHGRRFGLRKHRKH）是本实验室发现并命名的天然新型林蛙皮抗菌肽,富含Arg。生物信息学分析表明,其不稳定系数（Instability index）达到了52.19,而理论上认为不稳定系数低于40蛋白才能够稳定存在。根据现有的文献,改造抗菌肽dybowskin-2CDYa,将其Arg全部替换为Lys,并把第二位的Gla替换为Trp,改造后的抗菌肽命名为AWRK6。AWRK6（SWVGKHGKKFGLKKHKKH）由18个氨基酸构成,分子量为2130.5,利用HNN法预测其二级结构,其结构主要为α-螺旋,等电点为9.60,不稳定系数为-6.74,说明抗菌肽AWRK6稳定性优于Dybowskin-2CDYa。将改造后的抗菌肽AWRK6基因利用SOE-PCR方法获得AWRK6全长基因,连接酵母分泌型表达载体pPICZα-A,构建了pPICZα-AWRK6酵母表达质粒,重组质粒经Sac I酶切线性化后,电转化巴斯德毕赤酵母X33,构建真核表达系统,采用Zeocin筛选阳性菌株、PCR方法验证阳性菌株。阳性转化子经甲醇诱导表达后,利用α-factor引物、3’AOX引物对反转录cDNA进行扩增,获得300 bp左右的扩增产物,与目的基因AWRK6大小吻合,说明目的基因已插入宿主染色体中并已转录。对发酵液进行活性测定,抑菌活性显示,重组抗菌肽AWRK6对革兰氏阴性菌（大肠杆菌O157）,革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）均有抑制活性。结论:将富含精氨酸抗菌肽所有的精氨酸残基替换为赖氨酸残基,可提高其抗菌活性。利用巴斯德毕赤酵母X33表达体系能够正确表达新型抗菌肽AWRK6基因。抗菌肽AWRK6的二级结构以α-螺旋结构为主的两亲性螺旋结构。AWRK6对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有抗菌活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 0.1 概述
• 0.2 影响抗菌肽抗菌活性的因素
• 0.2.1 螺旋度
• 0.2.2 疏水性
• 0.2.3 两亲性
• 0.2.4 正电荷数
• 0.2.5 特殊氨基酸残基及末端氨基酸的作用
• 0.2.6 氨基酸的构型
• 0.3 改造天然抗菌肽的方法
• 0.3.1 氨基酸残基替换
• 0.3.2 截取天然抗菌肽的部分序列
• 0.3.3 序列模板法
• 0.3.4 杂合肽的设计
• 0.3.5 组合化学库法
• 0.3.6 螺旋轮法
• 0.4 实验目的及意义
• 第1章 新型抗菌肽 AWRK6 的优化构建及生物信息学预测
• 1.1 引言
• 1.2 研究方法
• 1.3 抗菌肽 Dybowskin-2CDYa 的物化特性分析
• 1.4 预测二级结构
• 1.4.1 HNN 法预测二级结构
• 1.4.2 ArgusLab4.0 模拟二级结构
• 1.5 两亲性预测
• 1.6 讨论
• 第2章 新型抗菌肽 AWRK6 表达载体的构建
• 2.1 引言
• 2.2 菌种和载体
• 2.3 工具酶与生化试剂
• 2.4 主要仪器和设备
• 2.5 溶液与培养基的配制
• 2.6 方法
• 2.6.1 实验策略
• 2.6.2 引物设计
• 2.6.3 AWRK6 序列扩增
• 2.6.4 表达质粒的构建
• 2.6.5 阳性重组质粒的测序与分析
• 2.7 结果
• 2.7.1 AWRK6 序列扩增
• 2.7.2 AWRK6 基因及 pPICZα-A 黏性末端的制备结果
• 2.7.3 阳性重组质粒的PCR 鉴定结果
• 2.7.4 阳性重组质粒的测序结果
• 2.8 讨论
• 第3章 抗菌肽 AWRK6 在毕赤酵母中表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验菌种
• 3.2.2 工具酶与生化试剂
• 3.2.3 主要仪器和设备
• 3.2.4 溶液与培养基的配制
• 3.2.5 方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 重组质粒线性化结果
• 3.3.2 酵母转化子的筛选及鉴定
• 3.3.3 发酵上清液的纯化
• 3.3.4 抑菌活性鉴定
• 3.3.5 dybowskin-2CDYa 和 AWRK6 活性对比
• 3.4 讨论
• 第4章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况