PTEN调节软骨细胞增殖与分化并抑制软骨发育障碍的发生

论文摘要

软骨是大部分骨骼的发育引擎,它的发育受到多种信号通路的协同调节。这些信号通路由各种因素驱动,包括细胞因子和激素如Indian hedgehog（Ihh）、甲状旁腺激素相关多肽（parathyroid hormone-related peptide,PTHrP）、转化生长因子β（transforming growth factorβ,TGF-β）超家族分子、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）,也包括转录因子如Sox（SRY-related high mobility group-box gene）家族、Runx2（runt-related transcription factor 2）、缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）,以及各种应激因素如内质网应激反应（endoplasmic reticulum stress ,ERSS）等等。这些信号通路涉及调控软骨细胞的增殖、分化、迁移、凋亡以及细胞稳态的维持。当这些过程发生异常时,会使软骨内成骨过程受损,导致各种骨骼疾病的发生。软骨发育障碍是以多发性内生性软骨瘤为特征的软骨发育异常疾病,好发于青壮年,以疼痛、骨骼畸形和病理性骨折为主要临床表现。到目前为止,人们对软骨发育障碍的发生发展过程和分子机制知之甚少。10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(（Phosphatase and Tensin homolog deleted from chromosome 10,PTEN）是一个重要的抑癌分子,它通过负向调控磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3 kinase,PI3K）信号通路来维持细胞稳态,调节细胞的增殖、分化、迁移、凋亡和黏附。PTEN是最重要的抑癌基因之一,它的缺失和突变与人类遗传性疾病和肿瘤的发生密切相关。然而PTEN与软骨内成骨和软骨发育障碍之间的关系仍未明确。在本研究中,我们通过条件基因敲除技术获得了软骨细胞特异性的PTEN基因敲除小鼠,使我们能够深入探索PTEN调节的PI3K/Akt信号通路在软骨发育和骨骼疾病中的作用。PTEN基因敲除使生长板软骨细胞中Akt得到磷酸化激活,基因敲除小鼠体长增长并发生与人类内生性软骨瘤相类似的软骨发育障碍表型。通过BrdU掺入法跟踪观察发育中的生长板软骨细胞增殖情况,利用原位杂交和BrdU标记-示踪法分析生长板软骨细胞的分化情况,我们发现PTEN基因敲除导致生长板软骨细胞增殖和分化不均一,致使增殖和分化受阻的静息软骨细胞在生长板中央形成瘤核样的结构。瘤核随着生长板的生长逐渐被遗落入骨髓腔内形成位于生长板下端的瘤样软骨结节。组织学观察显示瘤样软骨结节具有典型的内生性软骨瘤病理学特征。除此之外,PTEN基因敲除的生长板排列和分化紊乱,伴有关节变形,关节软骨损耗等病理改变。因此,通过在软骨细胞中特异性地敲除PTEN基因,我们获得了软骨发育障碍的小鼠模型,为我们研究这个疾病提供了理想的遗传学工具。在软骨细胞特异性PTEN基因敲除小鼠体内,瘤核样结构的出现是内生性软骨瘤发生过程中最关键的事件,它们被认为是内生性软骨瘤的雏形。我们发现瘤核内的软骨细胞发生了严重的ERSS。免疫组化和电镜观察显示瘤核内细胞外基质成分的特性和分布发生异常,大量的以2型胶原（type II collagen,Col II）为代表的胞外基质成分堆积在瘤核细胞的内质网腔。伴随着ERSS相关基因免疫球蛋白结合蛋白（binding Ig protein,BiP）表达的上升,软骨细胞的内质网腔发生明显的扩张和破裂,胞外基质的分泌严重受损。我们进一步研究发现只有在低氧环境下,PTEN基因敲除才能导致软骨细胞发生ERSS,同时伴随着软骨细胞分化下降,揭示了PTEN敲除和低氧在ERSS发生过程中的协同作用。在软骨细胞特异性PTEN基因敲除小鼠的生长板软骨中,我们不仅发现了ERSS相关基因表达的上升,也发现了HIF-1α信号通路的活化。免疫组化和原位杂交的结果显示在PTEN基因敲除的生长板中HIF-1α和下游靶基因如血管内皮细胞生长因子（ vascular endothelial growth factor , VEGF ）、磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate-kinase,PGK）、p21、p57在生长板的中央区域表达异常升高。异常活化的HIF-1α信号通路导致这个区域的软骨细胞增殖停滞,导致软骨周围血管生成增加并侵入生长板。我们还发现在HIF-1α信号通路发生异常活化的部位随后发生了ERSS,形成瘤核。体外实验证实PTEN敲除导致软骨细胞HIF-1α信号通路在低氧条件下发生了过度的活化,且先于ERSS的发生,提示PI3K/Akt信号通路可能通过HIF-1α信号通路调节软骨细胞对低氧的反应,并影响ERSS的发生。在本研究中,我们首次提供了体内的遗传学证据表明PTEN通过抑制HIF-1α信号通路的过度激活,通过抑制ERSS的发生,调节软骨细胞的增殖和分化,在维持生长板软骨的有序结构,抑制软骨发育障碍的过程中发挥着重要作用。我们的研究成果为人们认识软骨发育障碍这一疾病提供了宝贵的参考。

论文目录

• 常用缩略词
• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 软骨内成骨
• 1.2 调控软骨内成骨的信号通路
• 1.2.1 Ihh/PTHrP反馈环路：调控生长板软骨细胞增殖和分化的核心信号通路
• 1.2.2 Sox9：调控软骨发生和维持的核心转录因子
• 1.2.3 TGF-β超家族信号通路：关键作用贯穿软骨内成骨过程的始终
• 1.2.4 FGF信号通路：调控软骨细胞增殖与分化
• 1.2.5 HIF-1α信号通路：调控软骨细胞对低氧的反应
• 1.2.6 ERSS信号通路：参与调控软骨细胞的增殖与分化
• 1.3 软骨肿瘤与软骨发育障碍
• 1.4 P13K/Akt信号通路
• 1.5 目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验动物
• 2.2 基因组DNA的提取和基因型鉴定
• 2.3 LacZ染色检测Cre重组酶的功能
• 2.4 骨架制备
• 2.5 Southern blot
• 2.6 石蜡包埋、切片及HE染色
• 2.7 软骨的特殊染色法
• 2.8 BrdU掺入法检测细胞增殖和示踪细胞谱系分化
• 2.9 免疫组织化学
• 2.10 软骨细胞的分离培养和处理
• 2.11 用TRIzol从细胞中抽提RNA、DNA和蛋白
• 2.12 Real-time RT-PCR
• 2.13 细胞和组织蛋白质的提取及蛋白浓度测定
• 2.14 Western Blot
• 2.15 全组织免疫组化
• 2.16 普通原位杂交
• 第三章 PTEN调节软骨细胞增殖与分化并抑制软骨发育障碍的发生
• 3.1 结果
• 3.1.1 PTEN在软骨细胞中被特异性地敲除
• 3.1.2 软骨细胞特异性PTEN基因敲除小鼠的大体形态发生显著改变
• 3.1.3 软骨细胞特异性PTEN基因敲除导致小鼠骨骼过度生长
• 3.1.4 软骨细胞特异性PTEN基因敲除小鼠发生软骨发育障碍
• 3.1.5 PTEN敲除导致生长板软骨细胞发生不均一增殖
• 3.1.6 PTEN敲除导致生长板软骨细胞各级分化异常
• 3.1.7 瘤核内异常的PTHrP信号导致软骨细胞肥大分化异常
• 3.1.8 PTEN敲除导致软骨细胞发生ERSS
• 3.1.9 PTEN敲除导致生长板中HIF-1α信号通路过度活化
• 3.2 讨论
• 结论
• 参考文献
• 在读期间发表论著及会议论文
• 致谢