论文摘要
黄瓜花叶病毒M株系在白肋烟上具有典型的症状恢复现象,本研究用提纯病毒和DAS-ELISA建立了CMV- M病毒定量检测方法。研究发现,症状严重程度与叶片中的病毒浓度呈正相关:最早发病的黄化叶每克病组织中病毒可高达790μg,而恢复叶片上部再发病的花叶症状病叶中每克病组织中病毒也可高达508μg,恢复叶片中病毒含量很低,每克叶片中最高也没有超过6μg,仅为发病叶片病毒浓度的1/85-1/135,也远低于根和茎中的病毒浓度。RT-PCR和生物学检测结果表明恢复叶片中确实存在具侵染活性的病毒,但在长达半个月以上时间内病毒一直保持很低浓度。结果表明恢复叶中可能存在有效的病毒防御机制,其具体机理有待进一步研究。烟草的症状恢复与与病毒不同株系遗传变异直接相关,测定M-CMV序列有较大的意义。黄瓜花叶病毒RNA2编码的两个蛋白RdRp,2b蛋白。2a基因编码产生RdRp,在RISC中是一重要物质,2b基因编码的2b蛋白是基因沉默的抑制子.本研究测定了RNA2部分序列而得到全序列,发现RNA2的核酸序列以及蛋白与亚组I其他株系的同源性极高。其核酸与Fny株系的同源性达98%,与Y株系的同源性达98%, 2a氨基酸与Fny株系的同源性达97%,与Y株系的同源性达98%,比较2b氨基酸与Fny株系2b的同源性达97%,与Y株系2b的同源性达100%。说明症状恢复的原因不仅在病毒,烟草也扮演了很重要的角色.正因为这两个基因重要,少不了对其进行大量的研究,需要获得这两个基因。本研究成功的将RNA2的ORF分为1200bp,1360bp,333bp三段并克隆到pMD18-T Vector上,并分别将这些质粒命名为P2b-T,P2a.3-T,P2a.5-T,酶切鉴定表明已经正确插入,并用P2b-T制备探针,为了进一步研究植株中是否有源自RNA2的siRNA,分布,量的多少及在RNA2上的定位打下基础,同时也为进一步把该两基因克隆进GFP打下基础,进而研究烟草症状的恢复与RNA沉默的关系。为探明2a基因在不同叶片中的时空表达,及其在恢复机制中的作用,需要采用血清学分析技术,制备特异性抗血清是关键。该基因编码的蛋白为非结构蛋白,不能够通过提纯病毒制备,本研究在比较原核表达和酵母表达的利弊后,将2a基因分段构建到pET-30a（+）上,并分别命名为P2a.3-30a,P2a.5-30a,在大肠杆菌中成功表达了P2a.3-30a,获得了高效表达63kDa的重组蛋白,制备了抗血清,ACP-ELISA检测发现效价达1:8192（1:213）,western-blot检测发现特异性极好,表明上游1200bp为2a基因的主要抗原区。病毒对寄主的致病性受到卫星病毒明显的影响,不同的卫星病毒影响不一样。本研究通过dsRNA技术鉴定发现,M-CMV没有卫星病毒存在,直接否定了症状恢复与卫星病毒间的关系。黄瓜花叶病毒是RNA病毒,突变机率相对较高,正是如此,出现了病毒株系繁多的局面。研究症状恢复机制,需要研究某些基因的有效变异,以其他株系来直接对比,可能因分化时间较长,难以找到与恢复相关的因子。再说M株系本来就是由其他株系突变而来,而以M株系为母本,筛选突变株,则是一个最好的办法。本研究通过单斑分离筛选突变株,得到恢复推迟到35 d的突变株,为进一步研究恢复机制提供有用试材。表明症状恢复与某些关键碱基突变有关。