人肺腺癌A549细胞适配体的筛选与鉴定

论文摘要

目的以人肺腺癌A549细胞为实验模型建立细胞SELEX的技术平台,筛选到与A549细胞亲和力较高的DNA适配体,用以区分A549和正常支气管上皮细胞,为将适配体应用于肺癌的诊断奠定基础。方法通过化学合成含35个随机碱基序列的单链DNA文库,将文库与肺腺癌A549细胞相孵育,洗掉与A549细胞不结合的单链DNA,将与靶细胞结合的单链DNA做PCR扩增,通过将PCR产物过亲和素琼脂糖凝胶柱,NaOH变性,转变成单链DNA作为次一级文库,重复以上过程进行体外进化筛选。过程中通过缩短孵育时间、增加洗涤次数、延长洗涤时间等方式调整筛选压力,在第4轮、第12轮采用正常人支气管上皮细胞Beas-2b进行负筛选,去掉与Beas-2b结合的单链DNA。应用流式细胞术监测进化中的文库与A549细胞的结合情况。将第15轮和第20轮筛选到的产物进行T-A克隆,随机挑选50个克隆进行测序和序列分析,并使用RNA Structure软件进行核酸二级结构预测和分析。结果流式细胞仪监测结果显示未筛选文库及第20轮文库与A549细胞结合的平均荧光强度分别为0.544、1.73,其相应的阳性率分别为0.1%、4.7%,第20轮文库与A549细胞的亲和性明显强于未筛选文库的亲和性。而未筛选文库、第16轮、第20轮文库筛选文库与负筛选细胞Beas-2b细胞结合的平均荧光强度几乎没有变化。测序结果发现第15轮和第20轮的筛选序列中均出现2对重复序列,且两轮中的重复序列无交叉。对第15轮、第20轮筛选到的序列进行二级结构预测,按其结构将其分为三个类型,第15轮筛选结果中家族1、2、3所占百分比分别为40.8%、32.7%和14.3%,第20轮筛选中家族1、2、3所占百分比分别为46%、4%和32%。结论建立了Cell-SELEX的技术平台,并成功应用到肺腺癌A549细胞适配体的筛选中,为探索将适配体应用于肿瘤细胞的识别与鉴定奠定了基础。

论文目录

• 中英文词汇对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附页
• 序列结果
• 测序峰图
• 综述
• 参考文献
• 在校期间已发表文章
• 致谢