论文摘要
高三尖杉酯碱是我国自主研制成功的高效抗白血病药物,其可能通过诱导白血病细胞分化和凋亡等机制发挥细胞毒作用,具体机制有待进一步研究。Rab作为Ras蛋白超家族的一类小G蛋白,参与细胞的内吞外排等蛋白转运过程,近年来发现某些Rab蛋白如Rab7与细胞的自噬以及凋亡过程密切相关。Rab7b是我们课题组自主发现的一个新的小G蛋白,与Rab7高度同源,特异性的表达在髓系细胞,并与人白血病细胞分化相关,前期研究发现其定位于溶酶体。本研究中我们检测了高三尖杉酯碱处理后K562细胞的自噬标记物LC3的表达和凋亡的变化及可能机制,以及抑制自噬后凋亡变化。并将Rab7b及其突变体转染到K562细胞,从正反两方面探讨Rab7b在HHT诱导K562细胞凋亡中的作用,并检测饥饿诱导自噬时Rab7b及其突变体在K562细胞中的亚细胞定位及在自噬通路中的可能作用。首先我们用MTT法检测HHT诱导K562细胞后细胞活力,用Annexin V/PI双染法检测K562细胞凋亡,并用Western blot检测自噬体的标志物LC3的表达,用自噬抑制剂3-Methyladenine （3-MA）抑制K562细胞自噬后检测HHT诱导的K562细胞凋亡变化,并用Western blot检测caspase3,9的蛋白表达及ERK1/2,Akt, Beclin 1的变化,同时,我们构建了Rab7b,Rab7b的持续活化型突变（Rab7b-Q67L）、Rab7b的失活型突变（Rab7b-ACC）和Rab7b干扰（Rab7b-RNAi）质粒,转染到K562细胞,用Annexin V/PI双染法检测表达不同的Rab7b突变型的K562细胞的凋亡变化,并用Western blot检测caspase3,9的蛋白表达及ERK1/2, Akt表达的不同,用EBSS液诱导K562细胞自噬,Western blot检测自噬体的标志物LC3及Rab7b的表达,把带绿荧光GFP的Rab7b-GFP、Rab7b的持续活化型突变（Rab7b-Q67L-GFP）、Rab7b的失活型突变（Rab7b-ACC-GFP）瞬时转染到K562细胞中,并用LC3B的荧光一抗或MDC标记自噬泡,EBSS饥饿诱导自噬后,用激光共聚焦显微镜观察Rab7b在K562细胞中的亚细胞定位及其与LC3或MDC的共定位情况,并用各种自噬通路的抑制剂后观察其对Rab7b亚细胞定位的影响。研究发现HHT诱导K562细胞后自噬减少凋亡增加,这种凋亡增加是caspase依赖性的,在下调Akt的同时ERK通路上调,Beclinl表达上调,自噬减少进一步促进凋亡增加。过表达Rab7b的K562细胞可进一步增强HHT诱导K562细胞凋亡作用。这一作用与Akt通路下调及ERK通路上调有关。饥饿诱导自噬时Rab7b表达增高,Rab7b定位于自噬体,它与MDC或LC3标记的自噬体有共定位,这种定位功能依赖于其定位序列。Rab7b参与饥饿诱导的自噬体形成过程,并参与内体与自噬体融合过程。本研究首次提出自噬在HHT治疗白血病中的作用机制,为自噬与肿瘤、自噬与凋亡的关系研究提出新的实验依据,为自噬的机制及新型小分子Rab7b在白血病的治疗及在自噬中的作用提供有力的实验证据。并将对白血病的诊断及治疗等方面的研究起到极大的推动作用。