环介导等温扩增技术检测疟原虫方法的建立及其应用

论文摘要

蚊媒传播的疟疾是一种严重危害人类健康和生命的热带传染病,在全世界人群中具有很高的发病率和致死率,已成为全球最重要的公共卫生问题之一,世界卫生组织已将疟疾和艾滋病、结核病一起列为全球三大公共卫生问题。准确诊断一直是疟疾防治工作的一个重要环节,显微镜检查作为金标准目前仍是诊断疟疾的主要手段。但是镜检需要专业的实验操作技术和丰富的经验,如今有经验的镜检人员越来越缺乏；PCR检测是另一种广泛使用的方法,尽管其敏感性高,但耗费时间长且需要特殊仪器、检测成本较高。因此迫切需要一种敏感、特异和简便的疟原虫检测方法。目的运用环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP）建立一种快速、简便、敏感度高的疟原虫检测方法。方法本研究确定疟原虫环子孢子蛋白（CSP）基因为靶基因,设计合成特异性LAMP引物。构建间日疟原虫18S核糖体小亚基ssRNA特异性基因片段的重组质粒DNA （Pv-rDNA）作为阳性对照。优化Mg2+浓度、dNTPs浓度、Bst DNA聚合酶添加量、反应温度、时间以及设计引物缺省试验。评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。检测133份患者血样,以显微镜检方法为金标准,比较LAMP和多重PCR法检测间日疟原虫的敏感性和特异性。初步应用LAMP法检测斯氏按蚊体内鼠约氏疟原虫,对其特异性和灵敏性进行评估。结果建立了采用LAMP技术快速检测人体内间日疟原虫的方法,LAMP法检测重组质粒DNA （Pv-rDNA）的灵敏度达到10-10,为传统PCR方法的100倍。镜检确诊的68例间日疟患者,43例恶性疟患者和22例非疟疾患者中,LAMP法和多重PCR检测间日疟原虫的敏感性为98.53%和97.06%,两法检测灵敏度一致；特异性为86.15%和100%,LAMP法低于多重PCR法。LAMP法的阳性预测值和阴性预测值分别为88.16%和98.25%,多重PCR的阳性预测值和阴性预测值分别为100%和97.01%。选择斯氏疟原虫唾液腺子孢子微线体SPECT2作为靶基因合成LAMP反应引物,用该法初步应用于斯氏按蚊体内鼠约氏疟原虫的检测,特异性好,敏感性为能检测出在80只阴性斯氏按蚊中有1只约氏疟原虫阳性的斯氏按蚊的混合样本。结论本研究建立的人体内间日疟原虫LAMP检测方法具有快速简便、敏感性高、设备要求低、成本低廉的特点,具有较好的现场应用前景；LAMP法初步应用于斯氏按蚊体内鼠约氏疟原虫的检测,特异性和敏感性均较好,为进一步研究蚊体内疟原虫子孢子LAMP法检测奠定基础。

论文目录

• 主要中英文缩写检索表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 疟疾的全球流行形势
• 1.1.2 疟疾的概况
• 1.1.3 疟疾检测方法的现状
• 1.1.4 疟疾传播媒介检测方法的现状
• 1.1.5 环介导等温扩增技术（LAMP）
• 1.2 本研究目的与意义、研究主要内容、技术路线、拟解决的主要问题及创新点
• 1.2.1 研究目的与意义
• 1.2.2 研究主要内容
• 1.2.3 技术路线
• 1.2.4 拟解决的主要问题及创新点
• 第二章 环介导等温扩增技术（LAMP）检测人体内间日疟原虫方法的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 LAMP反应条件优化
• 2.2.2 优化后的最适LAMP反应条件和体系
• 2.2.3 LAMP反应的特异性
• 2.2.4 LAMP反应的灵敏性
• 2.3 讨论
• 第三章 环介导等温扩增技术（LAMP）检测人体内间日疟原虫方法的应用
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 第四章 环介导等温扩增技术（LAMP）检测蚊体内鼠疟原虫方法的应用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 LAMP法检测斯氏按蚊体内鼠约氏疟原虫的特异性
• 4.2.2 LAMP法检测斯氏按蚊体内鼠约氏疟原虫的敏感性
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 硕士期间发表论文及参与主要科研工作
• 致谢